上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)及其在食品中病原微生物檢測(cè)的應(yīng)用

近年來，由食源性致病菌引發(fā)的食物中毒不斷發(fā)生，1996年日本發(fā)生了世界上規(guī)模最大的歷時(shí)3個(gè)月、波及40多個(gè)都府縣、涉及上萬人的大腸桿菌O157食物中毒事件；2001年因發(fā)生“瘋牛病”導(dǎo)致德國(guó)衛(wèi)生部部長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)部部長(zhǎng)辭職；2005年遍及整個(gè)東南亞的禽流感更為各國(guó)的食品安全部門敲響警鐘；2011美國(guó)23個(gè)州爆發(fā)了活禽引發(fā)的沙門氏菌疫情，造成將近100人感染；我國(guó)也爆發(fā)過多起由食源性致病菌引起的食物中毒事件，其中1999年爆發(fā)的大腸桿菌O157：H7中毒事件，中毒人數(shù)達(dá)2萬，其中死亡177人，給我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。

食品安全已成為世界各國(guó)共同面臨和關(guān)注的問題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一?？焖俣鴾?zhǔn)確地檢測(cè)出被稱為“頭號(hào)殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)，因此建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于從源頭制止食源性致病菌污染，預(yù)防中毒事件的發(fā)生具有重要意義。食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有微生物培養(yǎng)法、電阻電導(dǎo)測(cè)定法、細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)方法等。但傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)方法，不僅步驟復(fù)雜，而且耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度也不高，難以吸水紙上，拍干；

g.立即在每孔中加入底物混合液，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)；

h.揭開蓋板膜，在每孔中加入終止液，輕輕振蕩混勻；

i.終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀取吸光度值。

該試劑盒靈敏度0.04ppb，原奶樣本檢測(cè)限為0.1ppb，奶粉檢測(cè)限為0.5ppb，樣品回收率范圍90%±30%。

黃曲霉毒素M1快速檢測(cè)試紙條

試紙條將特異性的抗原以條帶狀固定在膜上，金標(biāo)抗體吸附在微孔中，待檢樣本溶解微孔的金標(biāo)抗體后通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)至固定抗原區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。

設(shè)備：溫育器；微量移液器。

檢測(cè)步驟：

a.將待檢奶樣和產(chǎn)品組分恢復(fù)至室溫；

b.打開鋁箔袋，取所需量金標(biāo)微孔和試紙條；

c.待檢奶樣充分搖勻后加入金標(biāo)微孔中，置于50℃溫育器中溫育；

d.將試紙條插入金標(biāo)微孔中反應(yīng)；

e.從金標(biāo)微孔中取出試紙條，去試紙條下端的樣品墊，判定結(jié)果。

結(jié)果判定：

陰性：T線比C線顏色深或者一致，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

陽性：T線比C線顏色淺或者沒有顏色，檢測(cè)結(jié)果為陽性。

無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙條均判為無效。

該試紙條對(duì)原奶和奶粉檢測(cè)限均為0.2ppb。

黃曲霉毒素M1膠體金檢測(cè)試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)?？梢詽M足大量試樣篩選的需要，可以在小型和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在商檢、衛(wèi)檢等基層容易普及。

適應(yīng)飛速發(fā)展的現(xiàn)代食品生產(chǎn)要求。上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)是一種新的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于基層單位中各種食源致病菌的快速篩查檢測(cè)。

食品中病原微生物快速檢測(cè)

技術(shù)常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

食品微生物快速檢驗(yàn)方法的研究始于上世紀(jì)80年代早期，隨著食源性疾病發(fā)病人數(shù)顯著增加，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，食源性疾病也呈上升趨勢(shì)，各國(guó)也越來越重視此項(xiàng)工作。近年來，人們采用免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行快速檢驗(yàn)方法的研究，使其發(fā)展更為迅速。傳統(tǒng)的食源性病原微生物的檢測(cè)、鑒定仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型等水平，存在操作煩瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果往往存在不同程度滯后等缺點(diǎn)，這不僅不利于食品安全管理體系及時(shí)驗(yàn)證控制措施實(shí)施效果，也不利于對(duì)潛在不安全產(chǎn)品迅速采取糾正措施。對(duì)食源性致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏、省時(shí)、省力和省成本的快速檢驗(yàn)方法已經(jīng)成為保證食品安全的迫切需求，從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展趨勢(shì)來說，快速方法是微生物檢測(cè)的一大方向。上世紀(jì)50年代以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)（如ELISA及免疫層析試紙條法）為基礎(chǔ)或以分子生物學(xué)法（如常規(guī)PCR及熒光定量PCR方法）為基礎(chǔ)的快速檢驗(yàn)方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展。ATP法、免疫法、和顯色培養(yǎng)基法在國(guó)外應(yīng)用相當(dāng)成功，國(guó)內(nèi)的許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)也在使用或正在考慮使用國(guó)外先進(jìn)的快速檢測(cè)技術(shù)，如紙片法、生物化學(xué)技術(shù)（如PCR技術(shù)和基因探針技術(shù)等）、選擇鑒定用培養(yǎng)基法、免疫學(xué)技術(shù)、細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（AMS）等。但這些方法中有些要求配備特殊的儀器，有些需要操作人員具有較高的技術(shù)水平，還有些財(cái)政和人力投入較大，因此絕大部分微生物快檢方法在基層單位暫時(shí)無法推廣應(yīng)用。目前應(yīng)用于微生物檢測(cè)的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見表1 。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)（up-converting phosphor technology，UPT）是基于上轉(zhuǎn)發(fā)光材料（up-converting phosphor，UCP）而發(fā)展起來的一種新型標(biāo)記技術(shù)，UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的納米級(jí)顆粒。由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，UCP可由紅外光激發(fā)而發(fā)射可見光——上轉(zhuǎn)發(fā)光（up-converting）。這種絕無僅有的性質(zhì)使UCP作為標(biāo)記物在生物分析中，以無本底干擾、無焠滅、適于多重分析和定量分析等具有顯著優(yōu)勢(shì)，從本質(zhì)上有別于傳統(tǒng)標(biāo)記物。因此一種叫做上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒免疫層析（UPT-LF）的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，因其具有對(duì)樣品種類的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設(shè)備的限制，操作過程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)原理

UCP包括3種主要成分：主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，可以出現(xiàn)反Stokes現(xiàn)象，即這種材料可在紅外光區(qū)（波長(zhǎng)>780nm）被激發(fā)，卻發(fā)射波長(zhǎng)遠(yuǎn)短于激發(fā)光的可見光（波長(zhǎng)為475～670nm），這一現(xiàn)象在自然界中并不存在，其基本原理是雙光子或多光子熒光，即能量上轉(zhuǎn)。選擇不同的吸收子、發(fā)射子和主基質(zhì)可使UCP具有不同的光學(xué)性質(zhì)，成為其使用靈活的基礎(chǔ)。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與經(jīng)典的免疫層析技術(shù)相結(jié)合，采用新型標(biāo)記物——UCP上轉(zhuǎn)發(fā)光材料，通過掃描分析光電信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原或抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)試紙條是由UPT與免疫層析共同組成，主要由試紙條以下5個(gè)部分組成：樣品墊、結(jié)合墊又稱結(jié)合物稀釋墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。疊合順序如圖1所示，通過粘膠固定于粘性底襯上。

各部分的作用分別為：樣品墊是滴加被檢樣品的部位；結(jié)合墊中含有標(biāo)記物-生物活性分子結(jié)合物，在加入被檢樣品后，其可在試紙條上發(fā)生免疫反應(yīng)；分析膜是免疫反應(yīng)發(fā)生的部位，因此是層析試紙的核心結(jié)構(gòu)，抗原、抗體等生物活性分子均固定其上作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶；吸水墊的虹吸作用為整個(gè)反應(yīng)過程中的液流提供動(dòng)力。為保證液體在試紙條上流動(dòng)的連續(xù)性，各個(gè)部分之間需要有一定的重疊區(qū)。

檢測(cè)時(shí)，首先將待檢樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用進(jìn)入結(jié)合墊，使其中固定的標(biāo)記物——生物活性分子結(jié)合物重新解離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開結(jié)合墊流入分析膜，向吸水墊的方向流動(dòng)。此過程中標(biāo)記物——生物活性分子結(jié)合物、目標(biāo)被檢物與檢測(cè)帶、質(zhì)控帶之間將發(fā)生一定的特異性免疫反應(yīng)，并通過具有指示性的標(biāo)記物產(chǎn)生反應(yīng)信號(hào)。依據(jù)所發(fā)生的免疫反應(yīng)方式的不同，可分為夾心模式與競(jìng)爭(zhēng)模式。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)發(fā)展的歷程

UCP作為生物標(biāo)記物所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在1995年便已引起了美國(guó)軍方的重視，在國(guó)防部下屬DARPA（Defense Advanced Research Projects Agency）的大力支持之下，開發(fā)了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的手持式傳感器以及流式細(xì)胞儀（如圖2），用于對(duì)戰(zhàn)場(chǎng)上可能使用的多種生物戰(zhàn)劑進(jìn)行快速的預(yù)警與鑒定。

國(guó)內(nèi)得益于我國(guó)稀土資源豐富，研究單位包括軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所楊瑞馥實(shí)驗(yàn)室、北京熱景生物技術(shù)公司，在2000年已經(jīng)完成了UCP顆粒的制備，而且在顆粒上有了一定的突破；2002年創(chuàng)造了以UCP為基礎(chǔ)的自主研制PCT；2003年，研制出了第一代UPT免疫分析儀；2005年研制出了第三代便攜式系統(tǒng)，應(yīng)用于國(guó)家安全、部隊(duì)、疾控生物戰(zhàn)劑檢測(cè)，在生物應(yīng)急領(lǐng)域，研制完成的UPT快速檢測(cè)系統(tǒng)（UPT生物傳感器及UPT免疫層析試紙）可檢測(cè)鼠疫菌、炭疽芽孢、布魯氏菌、抗鼠疫菌抗體、抗SARS-CoV抗體、霍亂O1菌、霍亂O139菌等多種病原體，已推廣多個(gè)地方疾控系統(tǒng)——北京市衛(wèi)生局、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、防化研究院、鼠疫防治系統(tǒng)等職能單位；2008年，UPT系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化；2011年獲得國(guó)內(nèi)第一個(gè)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)生產(chǎn)文號(hào)，并獲得了完整的工藝流程與系統(tǒng)產(chǎn)品，已經(jīng)開發(fā)出了面向臨床、生物反恐、食品安全快速檢測(cè)儀器及試劑，總共獲得12個(gè)產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)，該系列產(chǎn)品打破了國(guó)外技術(shù)的壟斷，項(xiàng)目產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床檢測(cè)、軍隊(duì)和地方生物反恐、食源性致病菌檢測(cè)等；2014年該項(xiàng)目獲得中華醫(yī)學(xué)會(huì)二等獎(jiǎng)、北京市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

UCP獨(dú)有的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象決定了它不存在背景干擾，Niedbala等（2001）報(bào)道了上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)已被應(yīng)用于免疫標(biāo)記分析，UCP作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以其適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點(diǎn)，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。2001年有學(xué)者報(bào)道，用上轉(zhuǎn)換熒光橫向流檢測(cè)特定核酸氨基酸序列是一種快速，靈敏的檢測(cè)DNA方法，可以識(shí)別人類乳頭狀瘤病毒16種類型的感染。Zuiderwijk M等（2003）報(bào)道了用雙抗體夾心免疫層析法，在上轉(zhuǎn)換熒光免疫技術(shù)和橫向流動(dòng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，可檢測(cè)病原體鏈球菌，檢測(cè)結(jié)果顯示，只需要1ng DNA即可檢測(cè)出肺炎鏈球菌，表明了UPT技術(shù)在傳染病領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。Zhongqiang Y，Lei Z等在2006年研究開發(fā)了基于側(cè)向流免疫上轉(zhuǎn)換UPT技術(shù)的生物傳感器，這種生物傳感器已經(jīng)被開發(fā)并用于快速定量檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌，研究原理是用納米級(jí)的UCP顆粒作為標(biāo)記物，采用夾心免疫層析法，在UPT——LF免疫分析系統(tǒng)的平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，從樣品處理到數(shù)據(jù)結(jié)果分析不到30分鐘。Vijaya等（2007），應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光法快速檢測(cè)呼吸道合胞病毒感染，此檢測(cè)設(shè)備運(yùn)用新型上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)，也是上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)第一次用于傳染性疾病的檢測(cè)，此設(shè)備設(shè)計(jì)便攜，

可以直觀的判定呼吸道合胞病毒（RSV）感染檢測(cè)，此種方法的臨床檢測(cè)靈敏度為90%，特異性為98.3%，與經(jīng)過RT-PCR驗(yàn)證的病毒培養(yǎng)相比較，相關(guān)系數(shù)達(dá)到96.2%。Corstjens等（2008），用UCP作為標(biāo)記的層析流技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞分泌的γ-干擾素，其分析靈敏度>2pg/mL。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在食品中

病原微生物檢測(cè)的應(yīng)用

據(jù)WHO估計(jì)，由于全球性食品貿(mào)易的快速增長(zhǎng)以及人口的流動(dòng)，飲食習(xí)慣的改變，新食源性致病菌不斷出現(xiàn)，全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)10億人，每年約有200萬兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細(xì)菌性致病菌所致。

食源性致病菌導(dǎo)致的疾病是食品安全的關(guān)鍵問題，其中動(dòng)物源性食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。UCP作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點(diǎn)，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。傳統(tǒng)的橫向流方法通常用有色顆粒標(biāo)記，像膠體金或著色，通過顏色識(shí)別結(jié)果，然而，定性以及較低的靈敏度限制了其檢測(cè)應(yīng)用，而UCP顆粒在最低檢測(cè)線下仍然可以檢測(cè)，用基于橫向流的上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)分析，可以在109CFU/mL的微生物環(huán)境下檢測(cè)到103CFU/mL的大腸桿菌O157：H7，濃度變異系數(shù)在0～107organism/mL之間均<10%，對(duì)于較小的微生物，最低檢測(cè)線在5ng/mL以下。而且，此技術(shù)可以進(jìn)行多重檢測(cè)，可同時(shí)進(jìn)行多靶標(biāo)檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，使用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙盒可對(duì)包括乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1、O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、副溶血弧菌、傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌在內(nèi)的10種食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，不增菌檢測(cè)敏感性為109～105CFU/mL，增菌敏感性<10CFU/mL。均可滿足食物樣本增菌檢測(cè)和腹瀉樣本直接檢測(cè)的靈敏度需求。線性擬合系數(shù)R2介于0.9～0.98之間，均具有良好的定量能力。每種試紙與其它9種菌之間無明顯交叉反應(yīng)，特異性良好。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景

李斯特氏菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食品致病菌，已經(jīng)成為威脅食品安全的頭號(hào)殺手，快速而準(zhǔn)確檢測(cè)出被稱為“頭號(hào)殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)，UCP作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點(diǎn)，確保了在檢測(cè)過程中高度的敏感性、穩(wěn)定性、安全性，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。同時(shí)上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)的UCP顆粒因其具有對(duì)樣品種類的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設(shè)備的限制，操作過程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來，可以廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)基層單位對(duì)食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及診斷。隨著對(duì)UCP研究的不斷深入，上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、產(chǎn)業(yè)需求以及發(fā)展前景將不可限量。