雞傳染性法氏囊病的病原體分離及檢測

鄒 躍

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾　161006）

雞傳染性法氏囊病的病原體分離及檢測

鄒 躍

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006）

雞傳染性法氏囊?。↖BD）是由傳染性法氏囊病病毒引起幼雞的一種急性、高度接觸性傳染病。發(fā)病率高、病程短。主要癥狀為腹瀉、顫抖、極度虛弱。法氏囊、腎臟的病變和腿肌胸肌出血，腺胃和肌胃交界處條狀出血是具有特征性的病變。幼雞感染后，可導(dǎo)致免疫抑制，并可誘發(fā)多種疾病或使多種疫苗免疫失敗。由于該病變異性強，加之飼養(yǎng)條件差、環(huán)境污染嚴(yán)重等因素，易發(fā)生抗原和毒力的變異，因此，分離現(xiàn)地毒株作為免疫原制備疫苗及卵黃抗體對于當(dāng)?shù)氐膫魅拘苑ㄊ夏也〉姆乐斡兄鴺O其重要的意義。本次試驗的目的在于對一例現(xiàn)地分離的IBD毒株病原毒力進行檢測以便摸清其是否適合于用作免疫原使用。

雞傳染性法氏囊病現(xiàn)地毒株病原毒力測定免疫原

1　病毒的分離

于市郊一肉雞養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)一例特征較為明顯的疑似IBD病例，剖檢癥狀為：骨骼肌廣泛存在斑塊狀出血，法氏囊出血、嚴(yán)重腫大，腎臟水腫并伴有出血點，整條腸道均有不同程度的出血。無菌采集病死雞法氏囊，在實驗室中無菌條件下按重量體積比1：3加入生理鹽水進行研磨，之后放入-40 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，最后一次融化后以5000 r/min離心10 min，分離上清液用細菌濾器過濾，最后放入-40 ℃冰箱保存。

2　病毒的繁殖

將SPF種雞蛋37 ℃孵化至11日齡，并在雞胚外殼上制作人工氣室，用分離到的病毒液以每胚0.2 ml的劑量接種雞胚絨毛尿囊膜，接種后蠟封，并放回溫箱繼續(xù)孵化。收集接種后48～144 h內(nèi)死亡雞胚的胚體，同樣用之前分離病毒的方法從胚體中分離病毒液。

3　病毒的鑒定

3.1動物回歸實驗

將之前通過SPF雞胚所繁殖的原倍病毒液接種21日齡的肉雞雛，接種方式為經(jīng)口滴入，每只接0.2 ml，共10只。接毒后觀察發(fā)病情況，并且在接毒第5 d剖殺觀察。

表1　發(fā)病及剖檢結(jié)果

結(jié)果：臨床和剖檢癥狀與IBD相吻合。

3.2瓊脂擴散試驗

將之前繁殖的胚毒液按原倍、2倍、4倍、8倍4個稀釋度進行IBD瓊脂擴散試驗。打孔方式為梅花孔，中心孔加IBD陽性血清，周圍孔加待測胚毒液和IBD抗原。加樣后溫箱37℃放置24h后觀察結(jié)果。

表2　瓊脂擴散試驗結(jié)果

結(jié)論：清晰沉淀線出至4倍稀釋度，說明該毒株為IBD病毒。

4　毒力測定

4.1ELD50測定

將SPF種雞蛋用孵化器37℃孵化至11日齡。

共測10-1～10-77個稀釋度，每個稀釋度接種4枚雞胚。采用人工氣室法接種絨毛尿囊膜，每胚接種0.2ml之前自繁的病毒液。記錄48～168h的死亡雞胚數(shù)量進行ELD50的計算。

表3　雞胚死亡記錄

計算ELD50所使用的公式為L+d（S-0.5）

L：最低稀釋倍數(shù)全死亡組對數(shù)； d：稀釋系數(shù)

S：最低稀釋倍數(shù)全死亡組至有死亡最低稀釋倍數(shù)組的死亡率之和

ELD50=-3+（-1）×（4/4+3/4+2/4+1/4+1/4-0.5）=-5.25

該毒株每0.2 ml接種量的ELD50為10-5.25

4.2毒株特異性檢測

將20枚11日齡的SPF雞胚分為2組，每組10枚，分別為中和組與對照組。其中對照組直接將病毒液稀釋至1000倍ELD50（對應(yīng)該毒株的ELD50結(jié)果最終稀釋倍數(shù)為10-2.25），利用人工氣室接種絨毛尿囊膜0.2 ml/胚；中和組將稀釋度為1 000倍ELD50的病毒液與原倍IBD抗血清1：1均勻混合，以同樣接種方式每胚接0.2 ml，接種后放入37 ℃孵化器繼續(xù)孵化，記錄2組48～168 h雞胚死亡數(shù)量。

表4　毒株特異性檢測結(jié)果

特異性判定標(biāo)準(zhǔn)：中和組全部健活，對照組死亡率超60%為特異性合格毒株。根據(jù)實驗結(jié)果該毒株特異性合格。

4.3雞胚毒力測定

將病毒液稀釋至1000倍ELD50（對應(yīng)該毒株的ELD50結(jié)果最終稀釋倍數(shù)為10-2.25），之后取20枚11日齡的SPF雞胚制作人工氣室，將稀釋后的病毒液接種絨毛尿囊膜，每胚接種0.2ml，接種后繼續(xù)孵化，記錄48～144h雞胚死亡數(shù)。

表5　雞胚毒力測定結(jié)果

規(guī)定時間內(nèi)死亡率超過80%為雞胚毒力合格毒株，該毒株死亡率為90%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

5　試驗結(jié)論

該毒株經(jīng)分離、繁殖以及最后得毒力測定，最后結(jié)果比較理想，0.2 ml接種量的ELD50為10-5.25；雞胚毒力試驗規(guī)定時間死亡率為90%；病毒特異性良好，符合用于制備IBD免疫原的各項標(biāo)準(zhǔn)，可以利用其進一步生產(chǎn)IBD滅活疫苗及卵黃抗體，預(yù)計可以達到理想的現(xiàn)地IBD防治效果。

［1］ 王賢，王殿富.雞傳染性法氏囊病現(xiàn)地毒株分離鑒定與應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)科技，1994，（12）：22-23.

［2］ 官丁明.IBDV地方流行毒株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］.廣西民族大學(xué)，2010.

［3］ 李建亮.傳染性法氏囊病病毒山東株的分離鑒定及其雞胚毒的免疫效果［D］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.