臍橙果肉中維生素C 的HPLC 分析研究

李玉明，肖 亮，李 薇，劉 劍

（衡陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008）

臍橙的營(yíng)養(yǎng)既豐富又全面，含有大量的維生素C 和胡蘿卜素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。人體不能合成維生素C，維生素C 的生理功能主要有抗壞血病，保證膠原蛋白的正常合成，保護(hù)牙齦，預(yù)防動(dòng)脈硬化，抗氧化作用[1]，治療貧血，防癌，提高人體的免疫力[2]，提高機(jī)體的應(yīng)急能力等[3]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-10Avp 高效液相色譜儀，UV2501 紫外- 可見(jiàn)分光光度儀，AS3120 超聲波脫氣裝置，AP-01 真空抽濾裝置，電子分析天平。

維生素C 標(biāo)樣（含量為99.7%），純水（自制），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），臍橙（市售）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流動(dòng)相的配制

將純水用0.45μm 微孔濾膜真空抽濾，裝在潔凈的大試劑瓶中，然后超聲波脫氣15 30min，備用。將甲醇用超聲波脫氣15 30min，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取50.0mg 維生素C 樣品，用純水溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)，定容至500mL，配制成0.1mg·mL-1的維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液，再配成濃度分別為0.02mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1的維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制

稱取一定量的臍橙果肉于研缽中，研磨充分，加適量0.1%的磷酸溶液，超聲波提取0.5h 后，過(guò)濾，將濾液高速離心5 10min，取上清液，再用純水稀釋定容至250mL，搖勻，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜真空抽濾，脫氣，待用[4-5]。

1.2.4 分析方法

配制好流動(dòng)相、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定最佳分析條件，再定量分析[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

將維生素C 用紫外光譜儀在波長(zhǎng)200 400nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在267nm時(shí)色譜圖的峰面積最大，波形最好，吸收最高。結(jié)合文獻(xiàn)資料，本實(shí)驗(yàn)選擇267nm和254nm為維生素C的HPLC分析檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相及流速的選擇

考慮到維生素C 在酸性環(huán)境中相對(duì)比較穩(wěn)定，起初選擇pH 值為酸性的流動(dòng)相，采用甲醇以及0.1%的磷酸以不同的比例混合作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果出現(xiàn)的峰雜亂，峰形不好，保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。然后改用純水作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，出峰很好，并采用現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)的方式來(lái)避免維生素C 的不穩(wěn)定性。

A.檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；流動(dòng)相：甲醇；流動(dòng)相流速：0.6mL·min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：10μL。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，維生素C 的出峰不理想，有較多雜峰。

圖1 A 測(cè)定條件下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

B.檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；流動(dòng)相：純水；流動(dòng)相流速：0.6mL·min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：10μL。

C.檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；流動(dòng)相：純水；流動(dòng)相流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：10μL。

圖2 C 測(cè)定條件下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

D.檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流動(dòng)相：純水；流動(dòng)相流速：0.8mL·min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：10μL。

圖3 D 測(cè)定條件下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

E.檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；流動(dòng)相：純水；流動(dòng)相流速：0.8mL·min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：15μL。

F.檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；流動(dòng)相：純水；流動(dòng)相流速：0.8mL· min-1；檢測(cè)溫度：25℃；進(jìn)樣：10μL。

圖4 E 測(cè)定條件下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 在F 測(cè)定條件下不同濃度的維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積以及保留時(shí)間

圖5 F 測(cè)定條件下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

由實(shí)驗(yàn)過(guò)程可知，用甲醇作流動(dòng)相時(shí)液相色譜峰峰形雜亂，純水作流動(dòng)相時(shí)，峰形相對(duì)來(lái)說(shuō)都較好。由圖1 到圖5 對(duì)比得出以下結(jié)論：維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程線性關(guān)系好，R2值比較接近且均在0.98 以上，保留時(shí)間波動(dòng)不大。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm，流動(dòng)相為純水，流動(dòng)相流速0.8mL·min-1，檢測(cè)溫度25℃，進(jìn)樣量為10μL時(shí)，HPLC 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好，峰形好，線性相關(guān)性最好。所以，臍橙果肉中維生素C 的HPLC 分析檢測(cè)條件為：以純水作流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm，流動(dòng)相速度為0.8mL·min-1，檢測(cè)溫度為25℃，進(jìn)樣量10μL。

2.3 維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

以純水作流動(dòng)相，檢測(cè)溫度為25℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm，流動(dòng)相速度為0.8mL·min-1，維生素C 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 待測(cè)樣品重復(fù)性的測(cè)定

樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2 結(jié)果表明，重復(fù)性的精密度相對(duì)較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%。重復(fù)性的精密度越高，偏差越小，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)中的隨機(jī)誤差小。

表2 樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文對(duì)臍橙果肉中維生素C 的HPLC 分析方法進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)條件探索，得出最佳實(shí)驗(yàn)條件為：以純水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm，流動(dòng)相流速為0.8mL·min-1；檢測(cè)溫度25℃。在此條件下得出的液相色譜峰峰形好，峰面積大，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2＝0.9993，臍橙果肉待測(cè)樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%，表明重復(fù)性的精密度高，實(shí)驗(yàn)中的隨機(jī)誤差小。該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確度高，適用于臍橙果肉中維生素C 含量的測(cè)定。

[1] 王鏡巖.生物化學(xué)(上冊(cè))[M].北京：高等教育出版社，2007：461-463.

[2] 吳梧桐.生物化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2007：54-55.

[3] 朱志偉.壞血病的克星-維生素C[J].大學(xué)化學(xué)，2010(25)：66-68.

[4] 于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：30-34.

[5] 何優(yōu)選，梁奇峰.高效液相色譜法測(cè)定梅縣沙田柚果肉中維生素C 的含量[J].光譜實(shí)驗(yàn) 室，2010，27(4)：1290-1293.

[6] 汪正范.色譜定量與定性分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：60-63.