膜聯(lián)蛋白7在轉(zhuǎn)移性激素敏感前列腺癌原發(fā)灶組織中的表達(dá)及其意義

林國(guó)文 ，葉定偉，戴 波，張海梁，沈益君，朱 耀，朱一平，施國(guó)海，馬春光，肖文軍，秦曉健，曹達(dá)龍

（復(fù)旦大學(xué)：1.附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科；2.上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032）

去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC）治療手段有限，預(yù)后差。多數(shù)確診晚期的前列腺癌患者經(jīng)過(guò)1.5～2年內(nèi)分泌治療后，不可避免進(jìn)展為CRPC 階段，其發(fā)生機(jī)制至今未明。近年有報(bào)道膜聯(lián)蛋白7（Annexin A7，ANXA7）與前列腺癌進(jìn)展關(guān)系密切［1－2］，但對(duì)激素敏感前列腺癌（hormone sensitive prostate cancer，HSPC）進(jìn)展為CRPC過(guò)程中ANXA7的作用尚不明確。本文利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)ANXA7蛋白在轉(zhuǎn)移性HSPC患者的原發(fā)灶組織中表達(dá)情況，并探討其表達(dá)差異的對(duì)預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2003年6月至2013年6月本院資料完整的轉(zhuǎn)移性HSPC 患者106例，均經(jīng)病理證實(shí)且確診時(shí)已發(fā)生骨轉(zhuǎn)移?；颊吣挲g56～89歲，平均年齡70歲；確診時(shí)血清PSA 3～5 577ng／mL，中位值為170ng／mL；采用TNM 分期，T1～T2期22例，T3期59例，T4期25例；N0期65例，N1期41例；Gleason評(píng)分＜8分36例，≥8分70例。另取前列腺增生組織20 例、CRPC 原發(fā)灶組織22 例作比較。CRPC判斷標(biāo)準(zhǔn)（文獻(xiàn)［3］）：①血清睪酮達(dá)去勢(shì)水平（＜50ng／dL）；②間隔2周連續(xù)3次PSA 升高；③二線內(nèi)分泌治療期間PSA 進(jìn)展；④可出現(xiàn)骨或軟組織病變進(jìn)展。所有患者臨床資料由原始病史獲得，內(nèi)分泌治療采用最大限度雄激素阻斷方法。生存期隨訪時(shí)間截止為2014年3月。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色方法 上述病例的原發(fā)灶組織石蠟切片脫蠟水化，采取煮沸修復(fù)（置入pH 值為8.0的EDTA 抗原修復(fù)液，煮沸30min）；PBS沖洗后滴加50μL 一抗（ANXA7，兔抗人，1∶60，ProteinTech公司），4℃過(guò)夜；PBS沖洗后滴加通用二抗，室溫下孵育60min；PBS沖洗后滴加100μL DBA 顯色液；蒸餾水沖洗，0.1%鹽酸分化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，香柏油封固。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性顯色為棕黃色顆粒，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果分析 ANXA7 表達(dá)定位于胞核和胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃或棕褐色［4］。按陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分率計(jì)算。400倍高倍鏡下觀察至少5 個(gè)視野，取其平均值。根據(jù)染色強(qiáng)度分為3個(gè)等級(jí)：陰性表達(dá)（－）：＜10%細(xì)胞出現(xiàn)著色；弱陽(yáng)性表達(dá)（＋）：＞10%細(xì)胞出現(xiàn)輕中度著色；強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（＋＋）：＞10%細(xì)胞出現(xiàn)重度著色。切片由我院2位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片。

1.2.3 預(yù)后指標(biāo) 疾病無(wú)進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS）定義為從一線激素治療開(kāi)始到進(jìn)入CRPC階段的時(shí)間長(zhǎng)度；總生存期（overall survival，OS）定義為從一線激素治療開(kāi)始到因任何原因患者死亡的時(shí)間長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，ANXA7在前列腺增生以及轉(zhuǎn)移性前列腺癌間表達(dá)差異，以及ANXA7表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)分析通過(guò)χ2檢驗(yàn)完成，生存分析采用單因素和多因素Cox回歸模型，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移性HSPC 和前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá) ANXA7蛋白均在兩類組織中表達(dá)，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)DAB 染色的棕黃色顆粒。其中，轉(zhuǎn)移性HSPC 組織陽(yáng)性表達(dá)率50／106（47.2%）；前列腺增生組織全部陽(yáng)性表達(dá)。前者的ANXA7蛋白陽(yáng)性率明顯低于后者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1A、1B、1C）。

圖1 轉(zhuǎn)移性HSPC和前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá)（免疫組化，×400）

2.2 轉(zhuǎn)移性HSPC與CRPC組織中ANXA7蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)移性HSPC 組織陽(yáng)性表達(dá)率50／106（47.2%），CRPC 組織陽(yáng)性表達(dá)率為3／22（13.6%）。其中，轉(zhuǎn)移性HSPC 和CRPC 組織中弱陽(yáng)性率分別為44／106（41.5%）和3／22（13.6%），而強(qiáng)陽(yáng)性率則為6／106（5.7%）和0，統(tǒng)計(jì)分析提示CRPC組相比前者ANXA7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.014，圖1A、1B、1D）。

2.3 ANXA7蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)移性HSPC 患者臨床病理特征的關(guān)系 將106例轉(zhuǎn)移性HSPC 患者病例進(jìn)行相關(guān)分析比較（表1）。ANXA7蛋白表達(dá)率與患者T 分期、N 分期和Gleason分期關(guān)系密切，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ANXA7蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)移性HSPC患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 ANXA7蛋白表達(dá)與HSPC 的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者PFS與OS 的相關(guān)分析 至隨訪結(jié)束，80.2%（85／106例）患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，PFS中位值為21.3月；62.3%（66／106例）患者最終死亡，OS 中位值為39.1月。將106 例HSPC 患者臨床病理特征及其ANXA7蛋白表達(dá)情況納入Cox回歸模型（表2、表3），單因素分析PFS相關(guān)因素包括ANXA7 蛋白表達(dá)、活檢Gleason評(píng)分，OS相關(guān)因素包括ANXA7蛋白表達(dá)、PSA 最低值、多西他賽化療療程；多因素分析提示僅ANXA7蛋白表達(dá)與PFS 正相關(guān)（陽(yáng)性表達(dá)者PFS 中位值為24.4月、陰性表達(dá)者為15.5月），ANXA7蛋白表達(dá)、PSA 最低值＜0.4ng／mL與OS正相關(guān)（陽(yáng)性表達(dá)者OS中位值為56.4月、陰性表達(dá)者為36.1月），差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 ANXA7蛋白差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移性HSPC患者生存曲線

表2 106例轉(zhuǎn)移性HSPC患者ANXA7蛋白表達(dá)與其PFS的相關(guān)性分析

表3 106例轉(zhuǎn)移性HSPC患者ANXA7蛋白表達(dá)與其OS的相關(guān)性分析

3 討論

前列腺癌由HSPC轉(zhuǎn)變成CRPC 階段是多種機(jī)制共同作用的疾病進(jìn)展過(guò)程。涉及信號(hào)通路傳導(dǎo)改變，癌基因與抑癌基因調(diào)節(jié)失衡，細(xì)胞因子表達(dá)異常以及雄激素受體（androgen receptor，AR）變異等諸多因素。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活或缺失被普遍認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，許多研究也報(bào)道癌基因／抑癌基因的調(diào)節(jié)改變與前列腺癌關(guān)系密切［5］。NOMURA等［6］發(fā)現(xiàn)癌基因Vav3 能 夠提高AR 的活性，加速CRPC 的發(fā)展，沉默Vav3可以抑制AR 的磷酸化，進(jìn)而加強(qiáng)多西他賽促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。KOH等［7］綜述了前人研究認(rèn)為，癌基因MYC在前列腺癌發(fā)生過(guò)程中扮演至關(guān)重要的角色，特別是在早期階段，MYC 通過(guò)異常激活核糖體合成和細(xì)胞分化過(guò)程中的信號(hào)通路加速了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。PTEN 是常見(jiàn)的抑癌基因，SIRCAR等［8］研究發(fā)現(xiàn)CRPC患者病理組織中PTEN 表達(dá)缺失高達(dá)77%，而且PTEN 表達(dá)缺失與Akt基因表達(dá)異常以及患者不良預(yù)后有關(guān)。

近年，抑癌基因ANXA7的表達(dá)缺失與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系被逐步揭示［9］。HSU等［10］比較不同分化類型的胃癌組織ANXA7表達(dá)情況，結(jié)果提示ANXA7表達(dá)減少或者缺失大多出現(xiàn)在分化較差的胃癌組織中。JIN等［11］研究發(fā)現(xiàn)ANXA7基因可抑制肝細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，敲除ANXA7基因則淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯增加。YADAV等［12］探索在惡性膠質(zhì)瘤中ANXA7表達(dá)缺失的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ANXA7表達(dá)缺失與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過(guò)表達(dá)有關(guān)，敲除ANXA7基因可使腫瘤細(xì)胞中EGFR 表達(dá)量升高，EGFR 信號(hào)通路異常激活。該研究還提示ANXA7低表達(dá)與患者病死率高、生存期 較短有 關(guān)。SONG等［13］研究發(fā) 現(xiàn)ANXA7與galectin－3蛋白相互作用，影響肝細(xì)胞肝癌的生物活性。DONG等［14］觀察到前列腺癌中同樣存在ANXA7的缺失表達(dá)。特別是在局部復(fù)發(fā)的晚期前列腺癌中，ANXA7蛋白表達(dá)相比早期前列腺癌組織顯著缺失。TOROSYAN等［15］則進(jìn)一步研究得出前列腺癌中ANXA7結(jié)構(gòu)改變和功能缺失可能與異常的核糖核蛋白表達(dá)有關(guān)。

為深入分析 HSPC 進(jìn)展為CRPC 過(guò)程中ANXA7的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較HSPC與CRPC組織、前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ANXA7在前列腺增生組織中全部表達(dá)，而在前列腺癌組織中表達(dá)率明顯下降，不到前者一半。這與以往研究結(jié)論類似，ANXA7表達(dá)減少或缺失與前列腺癌發(fā)生有關(guān)。我們針對(duì)HSPC 與CRPC 組織的比較研究發(fā)現(xiàn)伴隨疾病進(jìn)展，ANXA7蛋白的表達(dá)率逐步下降，HSPC 組織中有近五成表達(dá)，而CRPC組織僅有13.6%表達(dá)，且全部屬弱陽(yáng)性，表達(dá)差異顯著不同。這一結(jié)果初步證實(shí)ANXA7的表達(dá)缺失在前列腺癌疾病進(jìn)展為CRPC階段扮演重要角色。

在ANXA7蛋白表達(dá)與HSPC 患者臨床病理特征及生存期進(jìn)一步的相關(guān)分析中，我們發(fā)現(xiàn)T 分期和N 分期越高，ANXA7 蛋白表達(dá)率越低；Gleason評(píng)分越高，ANXA7蛋白表達(dá)率也越低?？紤]到上述臨床病理指標(biāo)一般認(rèn)為是前列腺癌惡性程度高、預(yù)后不佳的危險(xiǎn)因素，這一相關(guān)性研究提示ANXA7陰性表達(dá)可能與患者不良預(yù)后有關(guān)。我們進(jìn)一步行ANXA7與患者PFS及OS的生存分析證實(shí)了上述推斷，ANXA7表達(dá)陰性者，其PFS中位值較陽(yáng)性表達(dá)者少9個(gè)月，而OS中位值相比陽(yáng)性表達(dá)者則明顯減少達(dá)20個(gè)月，統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)為ANXA7表達(dá)缺失是患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。

本文在研究中探索抑癌基因ANXA7在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，得到初步的相關(guān)性結(jié)論，但針對(duì)ANXA7促進(jìn)前列腺癌疾病進(jìn)展的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，以往報(bào)道認(rèn)為AR 在疾病進(jìn)展中扮演不可或缺的重要角色，因此有關(guān)其作用機(jī)制的探討還需將ANXA7 放置在AR 信號(hào)通路異常激活、AR 突變及上調(diào)改變等相關(guān)方面深入研究。

總之，本研究結(jié)果提示抑癌基因ANXA7蛋白表達(dá)減少可能在轉(zhuǎn)移性前列腺癌疾病進(jìn)展中具有重要作用并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。盡早進(jìn)行ANXA7表達(dá)檢測(cè)有助于判斷患者預(yù)后、指導(dǎo)個(gè)體化治療以及為臨床試驗(yàn)提供分組依據(jù)。

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