左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中μ—calpain及caspase—3表達(dá)的影響

韓麗萍 王海燕 喬霜等

【摘要】康模罕狙芯渴峭ü鄄霯EV對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知情況及海馬組織中μ-calpain和caspase-3表達(dá)的影響，來探討LEV的抗癲癇作用及其機(jī)制。方法：取三周齡Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：NS組、LEV組、Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)建立癲癇大鼠模型，建模成功24 h后，LEV組和Li-pilo+LEV組分別給予200 mg/（kg·d） LEV。采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)與記憶的能力，免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果：1.與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)無顯著差異 （P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺(tái)次數(shù)則顯著增加（P<0.05），但未恢復(fù)到正常水平。2.與NS組相比，LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達(dá)無顯著變化（P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達(dá)則顯著減少（P<0.05），但未恢復(fù)到正常水平。結(jié)論：LEV 可以改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力，該作用可能是通過調(diào)節(jié)海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】左乙拉西坦；癲癇；μ-calpain；caspase-3

【中圖分類號(hào)】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0095-02

癲癇（epilepsy）是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一，全球約有3500萬患者，患病率為5%～7%，而我國也約有650萬患者正在遭受該病的困擾。癲癇是一組以腦部功能失常為特征的綜合征，具有突然的發(fā)作性，重復(fù)性，和短暫性為特點(diǎn)?？梢哉f是兒童期最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。而癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus， SE）是癲癇的嚴(yán)重狀態(tài)，是癲癇反復(fù)發(fā)作或持續(xù)狀態(tài)，可以造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，并引起認(rèn)知功能的損害。左乙拉西坦（Levetiracetam， LEV）作為國際上公認(rèn)的一種抗癲癇藥物（antiepileptic drugs， AEDs）的新品種，憑借其獨(dú)特的抗癲癇機(jī)制，臨床效果的高效和安全性及良好的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，目前已經(jīng)在國內(nèi)和歐美廣泛應(yīng)用于對(duì)癲癇的治療。LEV具有抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)雙重作用[1]。王海燕等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦在治療癲癇的同時(shí)，還會(huì)改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能。張巖等[3]在左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響研究中也觀察到，左乙拉西坦可改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究主要采用免疫組織化學(xué)染色法檢測LEV對(duì)癲癇大鼠海馬組織中μ-鈣蛋白酶（μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain）及半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表達(dá)的影響，并采用Morris水迷宮法檢測大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力，來探討LEV抗癲癇作用的機(jī)制及其對(duì)認(rèn)知的影響。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

取三周齡健康Wistar大鼠（55±10g）124只（佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄不限，隨機(jī)的分為四組：正常對(duì)照組（NS）28只，左乙拉西坦對(duì)照組（LEV）28只，癲癇對(duì)照組（Li-pilo）34只，左乙拉西坦治療組（Li-pilo+LEV）34只。

參考文獻(xiàn)制備癲癇大鼠模型：Li-pilo組和Li-pilo+LEV組的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化鋰127 mg/Kg，24h后再給予M膽堿受體阻滯劑丁溴東莨菪堿1 mg/Kg，30min后腹腔注射1% 匹羅卡品100 mg/Kg。觀察大鼠行為變化的情況。根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]，將達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠歸于致癇成功組；未達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)的大鼠，繼續(xù)注射匹羅卡品直至注射次數(shù)達(dá)到6次，若注射6次后仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，則歸于致癇不成功組，棄之不要。將造模成功大鼠繼續(xù)分為Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。NS組及LEV 對(duì)照組均在相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。

1. 2 方法

1.2.1 給藥方案 Li-pilo+LEV組和LEV組在成模24h后給予200 mg/（kg·d） LEV灌胃，Li-pilo組和NS組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日在相同時(shí)間點(diǎn)給予一次灌胃。

1.2.2 留取標(biāo)本及檢測指標(biāo)

（1）癲癇模型制備成功24h后，采用Morris水迷宮法每日測試各組大鼠的行為學(xué)指標(biāo)：①定位航行實(shí)驗(yàn)：每天分為2個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練大鼠4次，一共需要4天完成，觀察并記錄大鼠在60s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期，escapelatency），反應(yīng)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力；②空間搜索實(shí)驗(yàn)（spatial probe test）：即在第5d將平臺(tái)撤掉，觀察和記錄大鼠90s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)，用于測量大鼠對(duì)空間位置的記憶能力。

（2）LEV給藥后的第7、14、28天每組隨機(jī)選取8只大鼠，給予10%水合氯醛麻醉之后，斷頭處死，分離出大鼠的海馬組織，在 -70℃給予保存，免疫組化染色法檢測大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3的表達(dá)情況。

1.2.3 檢測試劑 LEV購于美國sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗體及免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用 表示，組間差異比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)一步用LSD法做兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試

與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)無顯著差異 （P>0.05）；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺(tái)次數(shù)則顯著增加（P<0.05），但未恢復(fù)到正常水平。（見表1）