MSPD睭PLC法快速測(cè)定水果?蔬菜中常用的7種農(nóng)藥殘留

劉柱等

摘要

[目的]建立同時(shí)檢測(cè)水果、蔬菜中7種常用農(nóng)藥殘留的基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD）-高效液相色譜法（HPLC）分析方法。[方法]供試樣品通過(guò)乙腈高速均質(zhì)提取，經(jīng)PSA和C18（2∶1）基質(zhì)分散固相萃取快速凈化，以C18柱進(jìn)行HLPC紫外多波長(zhǎng)檢測(cè)。通過(guò)流動(dòng)相、吸附劑種類和用量的選擇，加標(biāo)回收試驗(yàn)，建立和優(yōu)化了MSPDHPLC同時(shí)測(cè)定7種常用農(nóng)藥殘留的方法。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，7種常用農(nóng)藥在各濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)R均大于0.999；選取蘋果、草莓、番茄、黃瓜4種具有代表性水果、蔬菜進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率均大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5%以內(nèi)，檢出限（LOD，S/N=3）為0.01～0.06 mg/kg。[結(jié)論]研究表明，該MSPDHPLC方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可滿足多種水果、蔬菜中7種常用農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)的實(shí)際需要。

關(guān)鍵詞農(nóng)藥殘留；高效液相色譜；基質(zhì)分散固相萃取

中圖分類號(hào)S481+.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）21-274-03

水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留會(huì)在人體內(nèi)蓄積而造成慢性中毒，有的農(nóng)藥還有致畸、致癌和致突變作用，因此農(nóng)藥殘留問(wèn)題越來(lái)越引起世界的關(guān)注，各國(guó)政府及組織針對(duì)具體的水果和蔬菜限定了農(nóng)藥的最大殘留限量（MRLs），并且限量標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越低，因此進(jìn)一步加強(qiáng)水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)勢(shì)在必行[1]。多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)多采用氣相色譜法（GC）[2]和氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）[3]，如辛硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥和新型殺蟲劑啶蟲脒等則多采用GC和GCMS測(cè)定[4]，而熱不穩(wěn)定、強(qiáng)極性和難揮發(fā)的農(nóng)藥，如吡蟲啉、多菌靈、甲基托布津則不適用GC、GCMS分析[5]，除蟲脲、滅幼脲等苯?；孱愞r(nóng)藥則多采用HPLC紫外檢測(cè)法[6]，但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道能同時(shí)測(cè)定這些不同類型的農(nóng)藥殘留。筆者在該試驗(yàn)研究的除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷、阿維菌素、滅多威、吡蟲啉、甲基硫菌靈被廣泛用于番茄、黃瓜、韭菜、草莓、蘋果和葡萄等蔬菜水果的栽培種植，目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道中多是針對(duì)這些農(nóng)藥中的一種或幾種進(jìn)行分析，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道能同時(shí)測(cè)定這7種農(nóng)藥殘留。

水果、蔬菜基質(zhì)復(fù)雜，多含有大量的色素、有機(jī)酸、糖類和蛋白質(zhì)等，對(duì)檢測(cè)干擾較大，因此選擇合適的前處理方法在農(nóng)藥殘留分析中顯得尤為重要。農(nóng)藥殘留前處理技術(shù)主要包括基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD）[7]、SPE固相萃取[8]、微萃?。⊿PME）[9]、凝膠滲透色譜[10]方法等。筆者結(jié)合實(shí)際工作，在參考已有研究成果的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留的提取和凈化方式，選擇比較了多種固相萃取材料，建立了同時(shí)檢測(cè)水果、蔬菜中7種常用農(nóng)藥殘留的MSPDHPLC分析技術(shù)，為有效開展常用農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)和農(nóng)產(chǎn)品安全管理提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1

原料與試劑。標(biāo)準(zhǔn)品除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷、阿維菌素、滅多威、吡蟲啉、甲基硫菌靈（濃度均為1 000 mg/L），國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；N丙基乙二胺（PSA）、C18粉末、活性炭、費(fèi)羅里硅土，購(gòu)自上海安普科學(xué)儀器公司；甲醇、乙腈、磷酸，均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Merk公司；二氯甲烷、氯化鈉為分析純，購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司；水（Millipore公司超純水器制備，電阻率為18.2 MΩ·cm）；蘋果、草莓、番茄、黃瓜，均購(gòu)自超市。

1.1.2

主要儀器設(shè)備。Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)；Thermo高速冷凍離心機(jī)，Biofuge Stratos美國(guó)；天平（METTLER TOLEDO AB204L）；氮吹儀（HGC36A）；旋渦混合器（QT1），上海琪特分析儀器有限公司）；超聲儀（DS3510DTH），上海生析超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。分別準(zhǔn)確移取除蟲脲100 μl、滅幼脲100 μl、辛硫磷100 μl、阿維菌素100 μl、滅多威100 μl、甲基硫菌靈100 μl、吡蟲啉50 μl、甲基硫菌靈25 μl的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置10 ml容量瓶中，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，乙腈定容至刻度，配制成一定濃度的混合?biāo)準(zhǔn)標(biāo)儲(chǔ)備液，使用前乙腈稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2

樣品提取。將可食部分的水果、蔬菜切碎，放入粉碎機(jī)粉碎，制成待測(cè)樣，于-20～-16 ℃條件下保存，備用。

準(zhǔn)確稱取粉碎后的待測(cè)樣品25.0 g于250 ml燒杯中，加入50.0 ml乙腈，當(dāng)樣品含水量較低時(shí)再加10 ml水，于均質(zhì)機(jī)中15 000 r/min高速勻漿2 min，定量濾紙過(guò)濾到裝有8 ～10 g氯化鈉的100 ml具塞量筒中，收集濾液40～50 ml，劇烈振蕩2 min后室溫下靜置30 min，使濾液分層，準(zhǔn)確移取上層（乙腈層）10.0 ml于試管中，45 ℃下氮?dú)獯蹈?，精密加?.0 ml乙腈溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

1.2.3

樣品凈化。在濃縮后的提取液中加入吸附劑0.3 g，渦旋混合10 s后靜置2 min，然后重復(fù)渦旋一次，于5 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.4

色譜條件。Waters SunFireTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸；洗脫條件見(jiàn)表1；流速：1 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270、258、283、245、235 nm；進(jìn)樣量20 μl。

1.2.5

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。分別取“1.2.1”中的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液50、100、300、500、700 μl，用20%乙腈水定容至1 ml，得到5組水平濃度的標(biāo)樣，進(jìn)行HPLC分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，各組分的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6

不同材料對(duì)樣品的凈化效果和對(duì)農(nóng)殘的吸附性試驗(yàn)。分別使用C18、PSA、活性炭、費(fèi)羅里硅土4種粉末直接對(duì)加600 μl 7種混標(biāo)儲(chǔ)備液的乙腈進(jìn)行吸附性試驗(yàn)，然后進(jìn)行色譜分析，再分別使用這4種凈化材料對(duì)蘋果、草莓、番茄、黃瓜4種提取濃縮液進(jìn)行凈化處理，凈化后的提取液進(jìn)行色譜分析，比較凈化后的凈化液顏色和色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

考察了甲醇-水、均含0.1%磷酸的水-甲醇、水-乙腈、均含0.1%磷酸的水-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)7種農(nóng)藥殘留的分離效果。結(jié)果表明，水-乙腈作為流動(dòng)相可以達(dá)到分離的效果，但是分離時(shí)間很長(zhǎng)，峰形拖尾嚴(yán)重。使用乙腈的分離效率優(yōu)于甲醇，加入0.1%的磷酸能夠使各農(nóng)殘的峰形對(duì)稱、不拖尾。試驗(yàn)比較了添加不同濃度磷酸（0.05%、0.10%、0.20%）對(duì)色譜峰的影響，考慮峰形和色譜柱對(duì)流動(dòng)相pH的耐受能力，最終確定流動(dòng)相為均含01%磷酸的水-乙腈。

試驗(yàn)使用二極管陣列檢測(cè)器最對(duì)7種農(nóng)殘進(jìn)行了全掃描，結(jié)合各目標(biāo)物的吸收強(qiáng)度和雜質(zhì)干擾，最終選擇：270、258、283、245、235 nm 5種波長(zhǎng)對(duì)7種農(nóng)藥殘留進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。優(yōu)化條件下，7種農(nóng)殘的出峰順序依次為滅多威、吡蟲啉、甲基硫菌靈、除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷、阿維菌素，在245 nm下3.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間如圖1。

2.2 MSPD吸附劑的選擇和優(yōu)化

方法是將固相吸附劑直接加入經(jīng)過(guò)鹽析分層的樣品提取液中，從而進(jìn)一步吸附基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，但同時(shí)不同的吸附劑可能會(huì)同時(shí)全部或部分吸附目標(biāo)化合物導(dǎo)致回收率降低，從而影響測(cè)定結(jié)果，所以該研究依據(jù)“1.2.3”前處理方法，首先考察了C18、PSA、活性炭、費(fèi)羅里硅土4種凈化材料對(duì)7種農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)品在乙腈介質(zhì)中的吸附作用。由表2可知，C18和PSA對(duì)7種農(nóng)殘的吸附作用較小，空白回收率都在95%以上，故初步選定C18和PSA作為MSPD方法的吸附劑。

由于水果、蔬菜樣品含水量很高，與乙腈互溶，且乙腈通用性強(qiáng)，對(duì)農(nóng)藥溶解度較大，所以直接使用乙腈提取，鹽析分層后得到的提取液再通過(guò)紫外和可見(jiàn)光比色法考察了這2種吸附劑對(duì)蘋果、草莓、番茄、黃瓜樣品的凈化效果，結(jié)果表明，在除色方面PSA的凈化效果明顯好于C18吸附劑，這可能是因?yàn)镻SA材料的硅膠表面鍵合有極性官能團(tuán)（氨基），該官能團(tuán)為其有效成分，它能吸附樣品中的色素、強(qiáng)極性雜質(zhì)、有機(jī)酸、色素等，而單獨(dú)使用PSA凈化的提取液在200～300 nm的全掃描中依然有一定的吸收，故考慮到C18吸附劑的硅膠上接有的十八烷基官能團(tuán)為其有效成分，對(duì)非極性物質(zhì)有較高的去除效果，所以該MSPD方法選擇C18和PSA 2種組合材料作為吸附劑，組合材料PSA和C18的比例分別選擇1∶1、2∶1、3∶1、4∶1做一步優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，PSA和C18為1∶1時(shí)會(huì)影響樣品中色素類雜質(zhì)的凈化效果，3∶1時(shí)會(huì)影響樣品提取液在200～300 nm的凈化效果，故最終選擇PSA和C18的比例為2∶1，凈化效果良好。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

按照優(yōu)化后的分析方法對(duì)7種農(nóng)殘的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，在同等濃度下吡蟲啉和甲基硫菌靈的響應(yīng)較強(qiáng)，在配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時(shí)，吡蟲啉和甲基硫菌靈的濃度范圍分別為0.25～3.50 mg/L和0.1～1.4 mg/L，其余5種農(nóng)殘的濃度范圍為0.5～7.0 mg/L。以儀器響應(yīng)的峰面積Y對(duì)應(yīng)7種農(nóng)殘濃度X（mg/L）進(jìn)行線性回歸，7種農(nóng)殘?jiān)谙鄳?yīng)的濃度范圍內(nèi)的線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.999。采用空白樣品處理液添加7種農(nóng)殘，以信噪比S/N=3計(jì)算方法的檢出限（LOD）。由表3可見(jiàn)，7種農(nóng)殘的檢出限范圍為0.01～0.06 mg/kg。

2.4 精密度和回收率

為了擴(kuò)展方法的適用范圍，根據(jù)蔬菜和水果的分離，選取番茄、黃瓜作為蔬菜類基質(zhì)，選取蘋果和草莓作為水果類基質(zhì)，選取3個(gè)不同的加標(biāo)水平用優(yōu)化后的處理方法對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表4可見(jiàn)，7種農(nóng)殘?jiān)邳S瓜中的加標(biāo)回收率在82.4%～99.5%，RSD在0.9%～5.1%；在番茄中的加標(biāo)回收率在84.3%～101.3%，RSD在0.9%～3.8%；在蘋果中的加標(biāo)回收率在85.7%～102.3%，RSD在0.9%～4.8%；在草莓中的加標(biāo)回收率在82.7%～102.1%，RSD在1.0%～4.8%。

3 結(jié)論

該研究以PSA和C18（2∶1）為吸附劑，采用乙腈提取水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留，MSPD方法快速凈化，HPLC多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定，建立了番茄、黃瓜、蘋果和草莓中7種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)，在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，檢出限范圍在0.01～0.06 mg/kg，加標(biāo)回收率均大于80%，RSD均小于5.1%。試驗(yàn)證明，優(yōu)化后的MSPD方法能有效去除水果、蔬菜中復(fù)雜基質(zhì)的干擾成分，能獲得較好的回收率、重現(xiàn)性和較低檢出限，符合農(nóng)殘檢測(cè)的要求，該方法操作簡(jiǎn)單、效率高、分析可靠、結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)儀器要求相對(duì)不高，容易在不同水平的實(shí)驗(yàn)室推廣，為水果、蔬菜中7種常用農(nóng)藥殘留的測(cè)定提供了可靠的方法依據(jù)。

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