丙肝病毒RNA提取方法優(yōu)化研究

劉學(xué)敏　陳麗茹　馬冬雪等

[摘 要] 目的：比較微柱離心法與微柱負(fù)壓泵兩種核酸提取方法提取丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV RNA）優(yōu)劣。方法：對(duì)160例HCV抗體陽性的患者血清，分別采用兩種核酸提取方法提取HCV RNA，對(duì)所提RNA同時(shí)采用熒光定量技術(shù)檢測(cè)RNA含量，比較兩種方法提取純度、對(duì)檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性影響；結(jié)果：離心法提取RNA濃度純度明顯高于負(fù)壓泵法，兩種方法靈敏度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，離心法結(jié)果穩(wěn)定，高于負(fù)壓泵法近20 %，預(yù)計(jì)重復(fù)性達(dá)99 %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；結(jié)論：離心法有效提高了RNA提取效率，提高了檢測(cè)重復(fù)性。

[關(guān)鍵詞] 丙肝病毒，HCV；核酸提取；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B 文章編號(hào)：2095-5200（2015）05-050-03

丙型肝炎病毒（簡(jiǎn)稱丙肝病毒，Hepatitis C Virus， HCV）是慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC） 誘因之一[1-2]。HCV診斷需提取患者血清中HCV RNA 進(jìn)行檢測(cè)[3-4]。RNA提取質(zhì)量直接決定了診斷準(zhǔn)確性[5-6]。熒光定量法能準(zhǔn)確反映HCV患者體內(nèi)病毒載量，且檢測(cè)靈敏度和特異度高，能有效縮短檢測(cè)窗口期[7-8]。目前市場(chǎng)上多數(shù)試劑盒對(duì)HCV RNA提取采用酚-氯仿提取法，該提取法工作量大、操作復(fù)雜，提取純度和分離效率一般，日?？蒲泄ぷ髦须y度較大。本文擬通過純化柱方法提取HCV RNA，比較離心法與負(fù)壓泵法抽取方法提取HCV RNA優(yōu)劣，將提取RNA通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

160例HCV陽性血清標(biāo)本來自本院2014年5 ～ 12月門診及住院丙肝患者，陰性血清來自無肝病史且HCV RNA陰性健康體檢者。

1.2 儀器與試劑

Roche公司Light-cycle熒光定量PCR分析儀；兩種微柱核酸提取法所用試劑及PCR擴(kuò)增試劑均購自凱杰生物工程深圳有限公司，試劑盒最低檢測(cè)限為5.0×102 U/mL。

1.3 標(biāo)本采集

病人血清樣本分別加入2 mL以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝，并在3 h內(nèi)分離血漿，-80 ℃ 冰箱保存。

1.4 微柱負(fù)壓泵提取法

（1）將血清樣本標(biāo)記，分別取待測(cè)血漿和對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，向各管中加入100 μL裂解液（已加有助沉劑），用移液槍反復(fù)吹打5～8次，加入20 μL 去抑制劑，離心數(shù)秒，70 ℃反應(yīng)10 min；（2）離心數(shù)秒，分別向各樣品中加入110 μL無水乙醇，振蕩混勻，離心數(shù)秒；（3） 核酸提取柱插入連接管后，固定在負(fù)壓裝置上，并做上標(biāo)記，然后將上一步中所有液體小心轉(zhuǎn)入相應(yīng)核酸提取柱中，開啟負(fù)壓，抽干核酸提取柱中全部液體；（4）加入500 μL洗滌液A到提取柱內(nèi)，開啟負(fù)壓，抽干柱中所有液體；（5）加入500 μL洗滌液B，開啟負(fù)壓，抽干柱內(nèi)所有洗滌液；（6）取出核酸提取柱，放入無RNA酶2 mL離心管中，14000 r/min離心1 min，棄掉廢液及離心管；（7）將提取柱放入另一新無RNA酶2 mL離心管中，小心將50 μL洗脫液加在柱內(nèi)中央，靜置1 min； 10000 r/min離心1 min；（8）離心管中收集液即為HCV RNA溶液，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 微柱離心法

（1）將待測(cè)血漿和對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)品100 μL分別加入等體積已混有助沉劑裂解液充分裂解，再分別加入20 μL 去抑制劑，離心數(shù)秒，置70 ℃反應(yīng)10 min；（2）然后將上清轉(zhuǎn)移入加入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管中）；（3）在10000 r/min條件下離心45 s，去除收集管中廢液，并將吸附柱重新放入收集管中；（4）加500 μL去蛋白液RE，12000 r/min離心45 s，棄掉廢液；（5）加700 μL漂洗液RW，12000 r/min離心30 s，棄掉廢液；（6）加500 μL漂洗液RW，120000 r/min離心30 s，棄掉廢液。（7）將吸附柱放入收集管中，12000 r/min離心1 min，盡量去除漂洗液，減少殘留乙醇對(duì)下游反應(yīng)影響；（8）取出吸附柱，將其放入一個(gè)新無RNA 酶離心管中，加入50 μLDEPC水（事先在65℃-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2 min。12000 r/min離心30 s，收集得到RNA存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 HCV RNA定量檢測(cè)

兩種提取方法均采用相同試劑進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增均在儀器上一次完成。最低檢測(cè)下限均為500 U/mL。

1.7 靈敏度比較

HCV強(qiáng)陽性血清及用陰性血清10倍倍比稀釋系列稀釋血清標(biāo)本，將所有病例分成6組，分別用上述兩種方法提取HCV RNA，將提取RNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，定量結(jié)果計(jì)算對(duì)數(shù)值，比較兩種方法提取靈敏度。

1.8 重復(fù)性比較

取上述中等含量HCV RNA標(biāo)本1份，分別用上述兩種方法各提取核酸10次進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，定量結(jié)果計(jì)算對(duì)數(shù)值，比較兩種方法提取重復(fù)性。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS17.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為具有顯著差異，即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV RNA濃度和純度比較

將負(fù)壓泵法和離心法提取RNA隨機(jī)取出少量，用Nano drop 2000 分別檢測(cè)兩種方法提取RNA濃度和純度，進(jìn)行比較。結(jié)果如下表，用離心法提取RNA濃度明顯高于負(fù)壓泵法，而且從A260/280和A260/230比值來看，離心法提取RNA純度也明顯好于負(fù)壓泵法。

2.2 HCV陽性率分析

以負(fù)壓泵法及微柱離心法提取HCV RNA，進(jìn)行定量檢測(cè)，陽性率分別為60.6 %（97/160）、79.4 %（127/160）。微柱離心法所提RNA陽性率高于負(fù)壓泵提取法。

2.3 靈敏度分析

兩種核酸提取方法靈敏度無顯著性差別，基本都可以滿足臨床應(yīng)用。但微柱離心法檢測(cè)限相較于負(fù)壓泵發(fā)更低，對(duì)臨界值附近低濃度樣本提取效果更好。以微柱負(fù)壓泵提取法提取RNA，其濃度水平檢測(cè)下限為9.34×106 U/mL，中位數(shù)為4.16×104 copy/ mL；以微柱離心法提取RNA檢測(cè)其濃度水平，檢測(cè)下限為9.83×107 U/mL，中位數(shù)為8.82×104 copy/mL。將兩法結(jié)果換算成對(duì)數(shù)值經(jīng)t檢驗(yàn)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

2.4 重復(fù)性比較

取中等含量標(biāo)本1份，分別兩種方法各提取核酸10次，然后對(duì)所提RNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，定量結(jié)果對(duì)數(shù)值分別為：負(fù)壓泵法為4.26，變異系數(shù)（CV）為13.12%，微柱離心法為4.68，變異系數(shù)（CV）為0.86 %。即通過微柱離心法提取HCV RNA重復(fù)性好，可達(dá)99%以上。

3 討論

臨床上目前較多應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)HCV RNA進(jìn)行定量檢測(cè)[9-10]。這種方法采用閉管操作不易造成產(chǎn)物污染，具有敏感、特異、快速優(yōu)點(diǎn)[11-12]。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求較高，其中提取核酸作為擴(kuò)增反應(yīng)模板是整個(gè)檢測(cè)中最重要前期步驟，提取核酸處理方法不同可直接影響PCR效果與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果[13-14]。

本研究采用了負(fù)壓泵法和微柱離心法兩種方法分別提取HCV RNA，對(duì)兩種方法靈敏度、重復(fù)性以及所提RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩種核酸提取方法靈敏度無顯著性差別，但微柱離心法重復(fù)性明顯優(yōu)于負(fù)壓泵法，可達(dá)99 %以上。從提取RNA濃度和純度來看，微柱離心法提去濃度均在800～1000 ng /μL左右，而負(fù)壓泵法提取RNA濃度則在200～400 ng/μL左右，明顯低于微柱離心法提取RNA濃度。另一方面從提取純度（A260/280和A260/230比值）來看，微柱離心法提取RNA純度明顯比負(fù)壓泵法高。本研究結(jié)果顯示離心法提取，有效提高了RNA提取效率，提高了檢測(cè)重復(fù)性。

參 考 文 獻(xiàn)

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