• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑龍江和河北地區(qū)大青葉蛋白SDS—PAGE分析

    2015-10-21 18:44:32史連宏等
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2015年9期
    關(guān)鍵詞:大青葉鑒別

    史連宏等

    摘要:目的 建立黑龍江和河北地區(qū)大青葉蛋白指紋圖譜,為不同地區(qū)大青葉的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法 采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù),對(duì)黑龍江和河北地區(qū)的大青葉樣品進(jìn)行鑒別。結(jié)果 河北大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為168.2 kD,最小為19.8 kD,亞基1、6含量最高;黑龍江大慶大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為175 kD,最小為24.4 kD,亞基1、2、4含量最高;黑龍江哈爾濱大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為175 kD,最小為27.7 kD,亞基1、3含量最高。結(jié)論 SDS-PAGE技術(shù)可以用于鑒別不同地區(qū)大青葉。

    關(guān)鍵詞:大青葉;鑒別;十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.021

    中圖分類號(hào):R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5304(2015)09-0076-03

    Analysis on Isatidis Folium Protein in Heilongjiang and Hebei Provinces by SDS-PAGE SHI Lian-hong, YANG Xin, ZHAI Chun-mei, MENG Yong-hai (Key Laboratory of Basic and Application Research of North Chinese Medicine of the Ministry of Education, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Heilongjang Key Laboratory of Pharmacodynamic Material Bases of TCM and Nature Medicine, Harbin 150040, China)

    Abstract:Objective To build fingerprint of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces;To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Folium. Methods SDS-PAGE technology was used to identify the samples of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces. Results Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Hebei Province was 168.2 kD, and the minimum was 19.8 kD. The subunit 1 and 6 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Daqing area was 175 kD, and the minimum was 24.4 kD. The subunit 1, 2 and 4 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Harbin area was 175 kD, and the minimum was 27.7 kD. The subunit 1 and 3 had the highest contents. Conclusion SDS-PAGE technology can be used to identify Isatidis Folium in different areas.

    Key words:Isatidis Folium;identify;SDS-PAGE

    根據(jù)《中華人民共和國藥典》,正品板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根,菘藍(lán)的干燥葉為大青葉[1]。板藍(lán)根與大青葉性味相似,均為味苦、性寒,均有藥用功效和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,

    基金項(xiàng)目:黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H201473);黑龍江省博士后資助課題(LBH-Z12259);黑龍江省教育廳科研課題(12531622);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計(jì)劃項(xiàng)目(2012RCQ16)

    通訊作者:孟永海,E-mail:124391407@qq.com

    主要功效為涼血消腫、清熱解毒,有抗內(nèi)毒素的作用[2-3]。其不僅用于臨床治療,還可以預(yù)防疾病,應(yīng)用非常廣泛。本課題組前期建立了不同地區(qū)板藍(lán)根十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)指紋圖譜,明確了不同地區(qū)的板藍(lán)根有差異性,也有相似性[4]。在此基礎(chǔ)上,本研究建立不同地區(qū)大青葉SDS- PAGE指紋圖譜,探討其蛋白差異性。

    1 儀器與試藥

    酶標(biāo)儀MK3,Peikin Elmer;電泳儀和Universal HoodⅡ電泳自動(dòng)成像儀,美國BIO-RAD生化科技有限公司;Mettler Toledo電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MIKRO220R離心機(jī),HETTICH。

    SDS-PAGE所用試劑為BIO-RAD生化科技有限公司產(chǎn)品,其他試劑為國產(chǎn)分析純。大青葉樣品產(chǎn)地分別為黑龍江哈爾濱、黑龍江大慶、河北省趙縣,均為栽培品種,每個(gè)產(chǎn)地收集10個(gè)樣品,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王振月老師鑒定為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥葉,采用硅膠快速干燥保存。

    2 方法

    2.1 植物蛋白提取

    采用康為世紀(jì)植物蛋白提取試劑盒(貨號(hào)CW2033),按照植物蛋白提取說明書進(jìn)行操作。

    2.2 BCA法測(cè)定蛋白濃度

    參照文獻(xiàn)[5]方法。稀釋牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品配制方法見表1。配制BCA工作液:BCA工作液總量=(BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)+待測(cè)樣品)×復(fù)孔數(shù)×每個(gè)樣本BCA工作液體積。將稀釋好的A~G管BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品各25 μL分別加到作好標(biāo)記的96孔板微孔中,每個(gè)樣本做2~3個(gè)平行反應(yīng)。每孔加入BCA工作液200 μL,充分混勻,蓋上96孔板蓋,37 ℃孵育30 min。冷卻至室溫。用酶標(biāo)儀在540~590 nm范圍內(nèi)測(cè)定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中的蛋白濃度。蛋白濃度檢測(cè)范圍:20~2000 μg/mL。

    表1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品的配制

    管號(hào) 稀釋液(μL) BSA標(biāo)準(zhǔn)品(μL) BSA標(biāo)準(zhǔn)品終濃度(μg/μL)

    A 0 100 2

    B 200 200 1

    C 200 200(從B管中取) 0.5

    D 200 200(從C管中?。?0.25

    E 200 200(從D管中?。?0.125

    F 200 200(從E管中取) 0.062 5

    G 200 0 0

    2.3 蛋白完整性檢測(cè)

    2.3.1 灌制5%分離膠 ①選擇濃度5%PAGE分離膠,裝配好凝膠模具。②將不同體積的30%Acr-Bis(29∶1)、分離膠緩沖液和雙蒸水在小燒杯或試管中混合。③加入10%過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。④在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液,然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1~5 cm水層,使凝膠表面保持平整。⑤靜置20 min,待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后,表明凝膠已聚合。

    2.3.2 灌制10%濃縮膠 ①去除覆蓋在分離膠上的水層。②將不同體積的30%Acr-Bis(29∶1)、濃縮膠緩沖液和雙蒸水在一個(gè)小燒杯或試管中混合。③加入10%過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。④將濃縮膠溶液加至分離膠上,直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。⑤將梳子插入凝膠內(nèi),避免產(chǎn)生氣泡。⑥靜置10~20 min,等待濃縮膠聚合。⑦待凝膠聚合后,小心地拔出梳子,以免破壞加樣孔。⑧進(jìn)行常規(guī)電泳操作[6-8]。

    3 結(jié)果

    3.1 蛋白定量檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以蛋白濃度(μg/μL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式Y(jié)=0.401X+0.051計(jì)算大青葉蛋白含量。結(jié)果黑龍江哈爾濱、大慶及河北地區(qū)大青葉蛋白含量分別為1.85、2.05、1.68 μg/μL。加裂解液保證3個(gè)地區(qū)蛋白濃度一致,為下一步SDS-PAGE做準(zhǔn)備。

    3.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析

    應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)不同地區(qū)大青葉藥材進(jìn)行研究,黑龍江和河北地區(qū)大青葉蛋白的亞基分布見圖1,用考馬斯亮藍(lán)G250染色后大青葉蛋白質(zhì)條帶清晰,沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,條帶顏色越深說明蛋白含量越高,顏色越淺說明蛋白含量越低。標(biāo)準(zhǔn)蛋白所含亞基數(shù)約為11條,亞基的分子質(zhì)量范圍為10.5~175 kD。標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析見表2。

    3.3 不同地區(qū)大青葉蛋白泳道和條帶分析

    從圖1可以看出,河北大青葉亞基數(shù)約為9條,亞基分子質(zhì)量范圍為19.8~168.2 kD,亞基1、6含量最高,見表3。黑龍江哈爾濱大青葉所含亞基數(shù)約為5條,亞基分子質(zhì)量范圍為27.7~175 kD,亞基1、3含量最高,見表4。黑龍江大慶大青葉所含亞基數(shù)約為7條,亞基的分子質(zhì)量范圍為24.4~175 kD,亞基1、2、4含量最高,見表5。

    綜上,不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS-PAGE分離效果良好,黑龍江哈爾濱和大慶大青葉相同條帶為175 kD,河北和黑龍江哈爾濱大青葉相同條帶為67.7 kD,河北和黑龍江大慶大青葉相同條帶為24.7 kD,河北大青葉特征條帶為168.2、59.7、50.7、34.5、26.5、24.7、23.2、19.8 kD,黑龍江哈爾濱大青葉特征條帶為57.8、43.4、27.7 kD,黑龍江大慶大青葉特征條帶為138、62.7、45.5、37.1、31.2 kD。3個(gè)地區(qū)的大青葉有相似條帶,也有特征條帶。

    4 討論

    為了減少組間差異,本研究對(duì)每個(gè)產(chǎn)地的大青葉10個(gè)樣本混合后提取植物蛋白。由于黑龍江地區(qū)大青葉是從河北地區(qū)移栽而來,環(huán)境不同,因此選擇和黑龍江地區(qū)的大青葉進(jìn)行對(duì)比。經(jīng)初步研究,,移栽的大青葉在蛋白水平上發(fā)生了變化,但是否影響藥用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

    本研究利用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地大青葉樣品進(jìn)行研究,建立大青葉SDS-PAGE指紋圖譜,結(jié)果充分顯示了SDS-PAGE技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。說明SDS-PAGE技術(shù)能夠準(zhǔn)確地將不同地區(qū)的大青葉完全區(qū)分開來。SDS-PAGE技術(shù)主要用于品種鑒定,尤其是在分子水平上鑒定中藥材非??煽?,本研究進(jìn)一步說明SDS-PAGE技術(shù)應(yīng)用于中藥材鑒定是可行的,為現(xiàn)代中藥發(fā)展提供了實(shí)踐意義和依據(jù),為探求中藥材的生物學(xué)實(shí)質(zhì)提供了更為深入的線索。本研究在分子水平上為大青葉品種栽培、種質(zhì)資源研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)、來源分析提供了試驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:284.

    [2] 武彥文,高文遠(yuǎn),肖小河.大青葉的研究進(jìn)展[J].中成藥,2006,37(5):793-795.

    [3] 董娟娥,梁宗鎖,尉芹,等.不同區(qū)域松藍(lán)根、葉(板藍(lán)根、大青葉)有效成分含量差異[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2006,17(9):1613-1618.

    [4] 楊欣,王秋紅,邢娜,等.不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS-PAGE分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(7):86-88.

    [5] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantities of microgram of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem,1976,72:248-254.

    [6] 姜先剛,趙雨,張巍,等.人參水溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志,2008,28(6):873-875.

    [7] 陳宏,王振英,靳陽.用超敏感銀染SDS-PAGE方法繪制黃瓜、菜豆蛋白質(zhì)指紋圖譜[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2000,15(4):108-111.

    [8] 鄭虎占,董澤宏,佘靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用:第一卷[M].北京:學(xué)苑出版社,1997:323-324,328-335.

    (收稿日期:2015-01-29)

    (修回日期:2015-02-27;編輯:陳靜)

    猜你喜歡
    大青葉鑒別
    大青葉的故事
    大青葉的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展
    中藥大青葉成分與作用研究進(jìn)展
    避免長(zhǎng)期服用新復(fù)方大青葉片
    胎母輸血綜合征1例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    粉色蛋白石與相似寶玉石品種的鑒別
    初夏去火 不可單用板藍(lán)根
    樂活老年(2016年5期)2016-12-08 07:17:40
    利用溶解性表,提高學(xué)生在酸、堿、鹽等物質(zhì)鑒別中的能力
    顯微技術(shù)在牛黃清心丸(局方)質(zhì)量控制中的應(yīng)用
    血液檢驗(yàn)在貧血鑒別診斷中的作用探討
    今日健康(2016年12期)2016-11-17 19:20:27
    高清黄色对白视频在线免费看 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 女性被躁到高潮视频| 又大又黄又爽视频免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜福利,免费看| 一本久久精品| 久久国产乱子免费精品| 99热这里只有是精品50| 国产视频首页在线观看| 色94色欧美一区二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 老司机影院毛片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲精品一区蜜桃| 国内精品宾馆在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产 一区精品| 亚洲成色77777| 久久av网站| 免费人成在线观看视频色| 自线自在国产av| 久久精品国产亚洲网站| 在线 av 中文字幕| 大片免费播放器 马上看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 男男h啪啪无遮挡| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品亚洲成国产av| 久久99热这里只频精品6学生| 777米奇影视久久| 2022亚洲国产成人精品| 免费观看av网站的网址| 国产成人一区二区在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 久久99热6这里只有精品| 午夜老司机福利剧场| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| freevideosex欧美| 日本欧美视频一区| 女性被躁到高潮视频| 久久久国产一区二区| 国产成人精品无人区| 在线精品无人区一区二区三| 十八禁高潮呻吟视频 | 国产伦在线观看视频一区| 日日啪夜夜爽| 日韩一区二区三区影片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 有码 亚洲区| 亚洲av男天堂| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美+日韩+精品| 99热全是精品| 精品一区在线观看国产| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久狼人影院| 欧美日韩av久久| 69精品国产乱码久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产黄片美女视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产有黄有色有爽视频| 亚洲成人一二三区av| 国产高清国产精品国产三级| 免费观看在线日韩| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| videos熟女内射| 欧美一级a爱片免费观看看| 一级毛片我不卡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品自拍成人| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕亚洲精品专区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 有码 亚洲区| 大片电影免费在线观看免费| 久久久国产一区二区| 高清av免费在线| 国产精品三级大全| 免费av中文字幕在线| 欧美国产精品一级二级三级 | 自线自在国产av| 性色av一级| 秋霞在线观看毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 多毛熟女@视频| 久久久久久伊人网av| 日本色播在线视频| 亚洲av中文av极速乱| 制服丝袜香蕉在线| h日本视频在线播放| 内射极品少妇av片p| 久久亚洲国产成人精品v| 一级毛片aaaaaa免费看小| 丁香六月天网| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 成年人免费黄色播放视频 | 九草在线视频观看| 日韩成人伦理影院| 午夜福利,免费看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产日韩欧美在线精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品亚洲成国产av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲图色成人| 一个人免费看片子| 一个人免费看片子| 香蕉精品网在线| 曰老女人黄片| 免费观看的影片在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 久久青草综合色| 色视频在线一区二区三区| 国产精品成人在线| 免费观看a级毛片全部| 丰满乱子伦码专区| av女优亚洲男人天堂| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品福利在线免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 99久国产av精品国产电影| 一个人免费看片子| 人体艺术视频欧美日本| 成人国产麻豆网| 青春草亚洲视频在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 精品少妇内射三级| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一级,二级,三级黄色视频| 视频区图区小说| 亚洲av福利一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品久久久精品久久久| 亚洲国产色片| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久99热6这里只有精品| 成人二区视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产淫语在线视频| 欧美人与善性xxx| 熟女电影av网| 伊人亚洲综合成人网| 日日啪夜夜撸| 亚洲美女黄色视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人国产av品久久久| 久久国产精品大桥未久av | 免费观看性生交大片5| 大片免费播放器 马上看| 大香蕉97超碰在线| 韩国av在线不卡| 国产免费视频播放在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 中国三级夫妇交换| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩中字成人| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 色吧在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区在线观看av| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美另类一区| av在线播放精品| 五月天丁香电影| 国产乱来视频区| 内地一区二区视频在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 涩涩av久久男人的天堂| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲无线观看免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线天堂最新版资源| 久久99一区二区三区| 22中文网久久字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久国产乱子免费精品| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品三级大全| 最近中文字幕高清免费大全6| 好男人视频免费观看在线| 高清欧美精品videossex| 午夜激情福利司机影院| 久久精品久久久久久久性| 内地一区二区视频在线| 久久久久久人妻| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 赤兔流量卡办理| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧洲国产日韩| 免费av中文字幕在线| 能在线免费看毛片的网站| 精品人妻熟女av久视频| 久久99热6这里只有精品| 国产精品久久久久久久久免| 成人美女网站在线观看视频| 午夜福利,免费看| 国产av码专区亚洲av| 街头女战士在线观看网站| 又大又黄又爽视频免费| 九色成人免费人妻av| 精品少妇久久久久久888优播| 日本欧美国产在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产精品国产精品| 蜜桃在线观看..| 熟女电影av网| av福利片在线| 国国产精品蜜臀av免费| 久久 成人 亚洲| 99久久综合免费| 免费观看性生交大片5| 综合色丁香网| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一本一本综合久久| 婷婷色综合www| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲不卡免费看| 青春草视频在线免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一本色道久久久久久精品综合| 久久 成人 亚洲| 三级国产精品片| 99久久精品一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 黄片无遮挡物在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久97久久精品| 亚洲国产色片| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 三级经典国产精品| 亚洲av二区三区四区| 国产成人精品无人区| 久久国产精品大桥未久av | 国国产精品蜜臀av免费| 欧美精品国产亚洲| 久久影院123| 国产精品嫩草影院av在线观看| 91精品国产九色| 秋霞伦理黄片| 精品熟女少妇av免费看| 一级毛片 在线播放| 国产精品女同一区二区软件| 秋霞在线观看毛片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美人与善性xxx| 天天操日日干夜夜撸| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品女同一区二区软件| 黄色视频在线播放观看不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品成人在线| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久6这里有精品| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久精品免费免费高清| av福利片在线观看| 一区在线观看完整版| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲在久久综合| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 大片免费播放器 马上看| 丝袜在线中文字幕| 国产淫语在线视频| 免费观看在线日韩| 亚州av有码| xxx大片免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| av卡一久久| 色视频www国产| 内地一区二区视频在线| www.色视频.com| 日韩制服骚丝袜av| 国产成人精品婷婷| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品久久久久久久性| 久久久精品免费免费高清| 午夜福利网站1000一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 嫩草影院入口| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 晚上一个人看的免费电影| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品酒店卫生间| 久久99精品国语久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 丝瓜视频免费看黄片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲人与动物交配视频| 精品一品国产午夜福利视频| 我的老师免费观看完整版| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲四区av| 国产免费又黄又爽又色| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品人妻久久久影院| 国内精品宾馆在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久ye,这里只有精品| 国产淫片久久久久久久久| 热re99久久精品国产66热6| 熟女av电影| 久久久久久久久久人人人人人人| 一区在线观看完整版| 久久人人爽人人爽人人片va| 好男人视频免费观看在线| 欧美丝袜亚洲另类| 精品亚洲成国产av| 国产av码专区亚洲av| 精品久久久久久电影网| 好男人视频免费观看在线| 久久精品国产亚洲av天美| av福利片在线观看| 99久久精品热视频| 午夜免费鲁丝| videossex国产| 丝瓜视频免费看黄片| 99视频精品全部免费 在线| 国产黄色免费在线视频| 亚洲天堂av无毛| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产一区二区在线观看av| 久久青草综合色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 不卡视频在线观看欧美| 街头女战士在线观看网站| 国产精品女同一区二区软件| 久久精品夜色国产| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲成人av在线免费| 99久久精品热视频| av卡一久久| 老熟女久久久| 波野结衣二区三区在线| 草草在线视频免费看| 国精品久久久久久国模美| 免费黄网站久久成人精品| 国产成人精品福利久久| 极品人妻少妇av视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产精品国产精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧洲国产日韩| 99久久综合免费| 另类精品久久| 99久久精品一区二区三区| 久久99一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 简卡轻食公司| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久久久久久久亚洲| 国模一区二区三区四区视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 免费在线观看成人毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 22中文网久久字幕| av天堂久久9| 一级av片app| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久久伊人网av| 大片免费播放器 马上看| 日日啪夜夜爽| 亚洲av日韩在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 成人二区视频| 欧美最新免费一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 麻豆成人午夜福利视频| 国产在线男女| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 中文天堂在线官网| 久久97久久精品| 国产成人aa在线观看| 免费少妇av软件| 22中文网久久字幕| 国产亚洲91精品色在线| 美女视频免费永久观看网站| 午夜福利,免费看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 男人和女人高潮做爰伦理| av在线app专区| 日本黄大片高清| 日韩av免费高清视频| 99久国产av精品国产电影| 国产伦理片在线播放av一区| 街头女战士在线观看网站| 18禁在线播放成人免费| 男人狂女人下面高潮的视频| av天堂中文字幕网| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲人与动物交配视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 麻豆乱淫一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩大片免费观看网站| 国产精品一二三区在线看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品偷伦视频观看了| 六月丁香七月| 国产精品国产av在线观看| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产精品一区三区| 欧美3d第一页| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99久久精品热视频| 高清欧美精品videossex| 日韩电影二区| av播播在线观看一区| 嫩草影院入口| 男女无遮挡免费网站观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久6这里有精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久99一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 99久久人妻综合| 男的添女的下面高潮视频| 久久久久久久精品精品| 中文在线观看免费www的网站| 午夜日本视频在线| 最后的刺客免费高清国语| av专区在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 一区二区三区乱码不卡18| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久午夜欧美精品| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲精品一二三| 国产精品无大码| 日本爱情动作片www.在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 看免费成人av毛片| av免费在线看不卡| 美女视频免费永久观看网站| 国产av精品麻豆| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲精品日本国产第一区| 中文在线观看免费www的网站| 国产男人的电影天堂91| 国产一区二区在线观看av| 丝袜脚勾引网站| 在线播放无遮挡| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| kizo精华| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 特大巨黑吊av在线直播| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 午夜免费鲁丝| 久久婷婷青草| 一级毛片 在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 国产免费一级a男人的天堂| 久久韩国三级中文字幕| 国产在线男女| 日韩大片免费观看网站| 中文字幕制服av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产黄片视频在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产日韩欧美视频二区| 免费av不卡在线播放| 久久久久视频综合| 国产中年淑女户外野战色| 日本av手机在线免费观看| 久久精品国产a三级三级三级| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久鲁丝午夜福利片| √禁漫天堂资源中文www| 国产乱人偷精品视频| 欧美精品一区二区免费开放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产熟女午夜一区二区三区 | 亚洲国产最新在线播放| 亚洲国产精品999| 日韩av免费高清视频| 97在线人人人人妻| 亚洲熟女精品中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久6这里有精品| av专区在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜激情福利司机影院| 国产探花极品一区二区| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 在线观看av片永久免费下载| 国产亚洲精品久久久com| 久久久国产精品麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久这里有精品视频免费| 一级毛片 在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本与韩国留学比较| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲经典国产精华液单| 午夜免费鲁丝| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 免费大片黄手机在线观看| 搡老乐熟女国产| av在线老鸭窝| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲欧美清纯卡通| 人体艺术视频欧美日本| 成人无遮挡网站| 99视频精品全部免费 在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲性久久影院| 日韩强制内射视频| 秋霞伦理黄片| 国产成人精品婷婷| 少妇精品久久久久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区二区在线观看日韩| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美xxⅹ黑人| 嫩草影院入口| 久久久久国产网址| 亚洲国产精品一区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 十八禁高潮呻吟视频 | 国产中年淑女户外野战色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产高清不卡午夜福利| 最近中文字幕高清免费大全6| 97精品久久久久久久久久精品| 色网站视频免费| 日韩欧美精品免费久久| 最近中文字幕2019免费版| 好男人视频免费观看在线| 波野结衣二区三区在线| 毛片一级片免费看久久久久| 五月开心婷婷网| 日日爽夜夜爽网站| www.av在线官网国产| 美女福利国产在线| av有码第一页| 毛片一级片免费看久久久久| av天堂中文字幕网| 99九九在线精品视频 | 亚洲色图综合在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 天美传媒精品一区二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 一级爰片在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产淫片久久久久久久久| 久久久久久久久久成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 18禁在线播放成人免费| 99re6热这里在线精品视频| 黄色怎么调成土黄色| 国产在线免费精品| 嫩草影院入口| 欧美区成人在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 三级国产精品欧美在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡|