蘇姜豬Lrh—I基因PCR—SSCP多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

王利紅　袁旭紅　魏萍萍　張瑞　王維　李丹　林偉

摘要：為深入研究蘇姜豬肝受體類似物質(zhì)-1（Lrh-I）基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀間相關(guān)性，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中豬Lrh—I基因核酸序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）方法對(duì)蘇姜豬Lrh-I基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，引物P1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在7種SSCP條帶型，共有4個(gè)堿基突變位點(diǎn)，分別為27287662、27287593、27287535和27287511位；引物P2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在2種SSCP條帶型，堿基突變位于27423038位；將擴(kuò)增序列與豬Lrh-1CDS區(qū)進(jìn)行比對(duì)分析，其中27287662、27287593和27423038位的堿基突變位于配體結(jié)合域（LBD）區(qū)內(nèi)，且突變均屬同義突變，表明LBD區(qū)對(duì)于Lrh-I基因功能穩(wěn)定具有重要作用；不同堿基突變位點(diǎn)的基因頻率經(jīng)群體遺傳學(xué)分析，除27287511位點(diǎn)處于群體不平衡狀態(tài)（P<0.05）外，其他位點(diǎn)均達(dá)群體平衡狀態(tài)（P>0.05）；Lrh-I基因}）1和P2擴(kuò)增區(qū)SSCP不同類型蘇姜豬第1胎和第2胎平均產(chǎn)仔數(shù)間無(wú)顯著差異（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：蘇姜豬；肝受體類似物質(zhì)-1（Lrh-I）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）；產(chǎn)仔數(shù)

中圖分類號(hào)：Q953 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0021-04

肝受體類似物質(zhì)一1（1iver receptor homolog-1，Lrh-I）是核受體7個(gè)亞家族成員（NRO～NR6）中的第5個(gè)，該亞家族包含4個(gè)不同成員，Lrh-I是其中第2個(gè)，故也稱其為NR5A2（nuclear receptor subfamily 5，group A，menlber 2）。Lrh-I是動(dòng)物機(jī)體中一種重要的核受體，Lrh-I基因首次發(fā)現(xiàn)于小鼠肝組織，現(xiàn)已在人、大鼠、馬、雞、羊、魚、蛙、牛、豬等生物體內(nèi)均檢測(cè)到，并已確認(rèn)在動(dòng)物早期胚胎發(fā)育、分化以及物質(zhì)代謝活動(dòng)，如膽固醇代謝、膽汁酸動(dòng)態(tài)平衡、激素生成等過(guò)程中，Lrh-I基因具有重要作用。

蘇姜豬是以姜曲海豬、楓涇豬、杜洛克豬為親本，經(jīng)過(guò)6個(gè)世代繼代選育培育而成的新品種。該品種具有血統(tǒng)來(lái)源豐富、繁殖性能良好、肉質(zhì)性狀優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究采用PCR—SSCP方法首次進(jìn)行蘇姜豬Lrh-I基因核酸序列檢測(cè)分析，以期獲得蘇姜豬Lrh-I基因多態(tài)性及群體遺傳分布特點(diǎn)，并與產(chǎn)仔數(shù)性狀間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為深入研究Lrh-I基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與動(dòng)物繁殖性狀間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取50頭經(jīng)產(chǎn)蘇姜種母豬，用酚-氯仿抽提法提取耳組織DNA，超純水稀釋至100ng/ul，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2Lrh-I引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬Lrh-I基因序列JQ_527656.1、NM_001267893.1、NC_010452.3為依據(jù)，采用Primer premiers5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1）。

1.3PCR—SSCP檢測(cè)

依據(jù)表1中不同引物退火溫度，進(jìn)行樣本Lrh-I基因PCR擴(kuò)增。取5uL PCR產(chǎn)物和10uL變性劑[98%甲酰胺、0.025%二甲苯青、10%甘油、10 mmol/L EDTA（pH值8.O）、0.025%溴酚藍(lán)]，98℃變性10min，迅速冰浴10min。變性后產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺：甲又雙丙烯酰胺（29：1）凝膠中電泳，之后銀染顯帶，拍照分析。

1.4PCR產(chǎn)物測(cè)序

經(jīng)SSCP電泳后，將不同條帶型PCR產(chǎn)物送至上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。依據(jù)哈迪一溫伯格定律檢測(cè)相關(guān)基因頻率群體平衡性。

2.結(jié)果與分析

2.1Lrh-I基因2對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

Lrh-I基因2對(duì)引物P1和P2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結(jié)果顯示條帶清晰，表明該2對(duì)引物的PCR擴(kuò)增特異性好。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與豬，Lrh-I基因序列有高度相似性，引物Pl和P2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與JQ_773337.1、JQ_627655.1和NM_001267893.1序列覆蓋區(qū)相似度分別為99%和98%，表明本試驗(yàn)所擴(kuò)增的核酸序列在，Lrh-I基因區(qū)。

2.2SSCP分析

對(duì)Lrh-I基因2對(duì)引物PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果顯示均存在多態(tài)性。引物P1、P2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別存在7、2種SSCP條帶類型（圖2、圖3）。

2.3SSCP不同類型核酸序列分析

2.3.1引物P1 PCR-SSCP不同條帶類型核酸序列分析將SSCP不同條帶類型的引物Pl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與NC_010452.3進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，不同SSCP條帶類型核酸序列主要在NC-010452.3序列相應(yīng)的27287662、27287593、27287535和27287511這4個(gè)位點(diǎn)存在堿基差異。通過(guò)將引物P1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與NM_001267893.1序列進(jìn)行BLAST分析，可知27287662與27287593位點(diǎn)處于CDS區(qū)。27287662和27287593位點(diǎn)堿基突變分別為A-G和c-T，且均為同義突變；27287535和2728511位點(diǎn)則均為A-G的突變（表2）。

2.3.2引物P2 PCR—SSCP不同基因型核酸序列分析將引物P2 PCR擴(kuò)增的不同基因型產(chǎn)物序列與NC_010452.3進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在NC-010452.3序列對(duì)應(yīng)的27423038位存在A-C的同義突變（表3）。

2.3.3蘇姜豬，Lrh-I基因群體遺傳分析蘇姜豬，Lrh-I基因引物P1和P2擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型頻率以及基因頻率見表4至表6，結(jié)果顯示，引物P1擴(kuò)增區(qū)SSCP-1和SSCP-5型所占比率較高，在4個(gè)堿基突變位點(diǎn)中僅27287662位點(diǎn)存在3種基因型，另3個(gè)位點(diǎn)均缺少1種純合基因型。根據(jù)哈迪一溫伯格定律，對(duì)蘇姜豬，Lrh-I基因引物P1和P2擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行基因群體平衡性x檢驗(yàn)，結(jié)果表明，引物P1擴(kuò)增區(qū)27287662、27287593、27287535位點(diǎn)基因分布符合哈迪一溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)（P>0.05），27287511位點(diǎn)基因分布不符合哈迪一溫伯格定律，處于群體不平衡狀態(tài)（P<0.05）；引物P2擴(kuò)增區(qū)基因分布符合哈迪一溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)（P>0.05）（表7）。

2.3.4Lrh-I基因不同SSCP型與產(chǎn)仔數(shù)間相關(guān)性分析根據(jù)生產(chǎn)記錄對(duì)蘇姜豬進(jìn)行Lrh-I基因不同SSCP型產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（表8），結(jié)果表明，蘇姜豬，Lrh-I基因P1和P2擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型第1胎和第2胎平均產(chǎn)仔數(shù)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3.結(jié)論與討論

Lrh-I基因?qū)俸耸荏w亞家族，主要表達(dá)于動(dòng)物的肝臟、性腺、胰腺等組織。Lrh-I具有調(diào)節(jié)膽汁酸的平衡、類固醇合成、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)以及早期胚胎發(fā)育等功能。最近有研究認(rèn)為磷脂質(zhì)是Lrh-I潛在的配體。與其他配體激活轉(zhuǎn)錄因子的核受體家族成員一樣，Lrh-I具有保守的DNA結(jié)合域DBD（nuclear receptor-DNA binding domain-like）、可變的N末端、絞鏈區(qū)和一個(gè)C端配體結(jié)合域LBD（nuclear receptor-lingand binding domain_Lrh-1）。

豬Lrh-I基因位于10號(hào)染色體，其編碼區(qū)CDS（codingsequences）共有1332個(gè)堿基，可翻譯成含443個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，2個(gè)保守結(jié)合域DBD、LBD分別位于第40～80、203～443氨基酸區(qū)，DBD區(qū)含2個(gè)C4型鋅指結(jié)構(gòu)，LBD區(qū)含有3個(gè)特殊識(shí)別位：第235～240、242～244、321、422～424、426～428、430～431位氨基酸為同型二聚體界面位，也為多肽結(jié)合位；第244、247～248、284～285、288、292、307、318、321～323、326、329～330、415、418～419、422位氨基酸為配體結(jié)合位，也為化學(xué)結(jié)合位；第256、259、263、273、276～277、280～281、432～433、436～437位氨基酸為輔阻遏物識(shí)別位。

本研究通過(guò)PCR—SSCP方法，首次對(duì)蘇姜豬，Lrh-I基因序列LBD區(qū)部分序列進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)。引物P1 PCR擴(kuò)增區(qū)共檢測(cè)到7種SSCP條帶型，其中相對(duì)較高的條帶型為SSCP一1型（24%）和SSCP一5型（26%），表明在蘇姜豬群體中該區(qū)段的堿基差異較大，這可能與其源于多個(gè)豬品種的培育史有關(guān)。對(duì)不同SSCP型樣本核酸序列檢測(cè)分析，結(jié)果顯示共存在4處堿基突變位點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)于NC_010452.3序列的27287662、27287593、27287535和27287511位點(diǎn)，其中前2個(gè)位點(diǎn)處于豬Lrh-I基因CDS區(qū)。經(jīng)分析，在27287662位點(diǎn)存在A—G的堿基突變，位于密碼子的最后1位，即由原UUU密碼子變?yōu)閁UC，相對(duì)應(yīng)的氨基酸均為苯丙氨酸，處于豬Lrh-I蛋白質(zhì)氨基酸組成的第345位，未在特殊功能結(jié)合位；在27287593位點(diǎn)為c—T的堿基突變，也發(fā)生在密碼子的最后1位，即由原GCG密碼子變?yōu)镚CA，相對(duì)應(yīng)的氨基酸均為丙氨酸，處于豬Lrh-1蛋白質(zhì)氨基酸組成的第322位，位于配體結(jié)合位。然而，這2處堿基突變均為同義突變，對(duì)Lrh-I結(jié)構(gòu)及功能不會(huì)造成影響。引物P2PCR擴(kuò)增區(qū)共檢測(cè)到2種SSCP條帶類型（AA型和AB型），其中AA型（84%）所占比例遠(yuǎn)高于AB型（16%）。通過(guò)檢測(cè)2種類型樣本的核酸序列得知，在對(duì)應(yīng)的NC_010452.3序列27423038位存在A-c的堿基突變，該堿基位于密碼子第3位，使原密碼子CGG變?yōu)镃GU，相對(duì)應(yīng)的氨基酸均為精氨酸，屬同義突變，未對(duì)Lrh-I基因結(jié)構(gòu)及功能造成影響，進(jìn)一步體現(xiàn)Lrh-I基因LBD區(qū)域的保守性和功能重要性Lrh-I。對(duì)于LBD區(qū)其他未擴(kuò)增區(qū)段以及DBD區(qū)核酸序列是否也存在堿基突變情況，將在日后的研究中進(jìn)一步檢測(cè)分析。

蘇姜豬群體中引物P1擴(kuò)增區(qū)4個(gè)突變位點(diǎn)僅27287662位點(diǎn)存在3種基因型（CC、CD、DD），其他3個(gè)突變位點(diǎn)均缺少1種純合型，引物P2擴(kuò)增區(qū)也缺少1種純合型。經(jīng)基因群體遺傳平衡分析，除引物P1擴(kuò)增區(qū)27287511位點(diǎn)未達(dá)群體平衡（P<0.05）外，其他4個(gè)堿基突變位點(diǎn)均達(dá)群體平衡（P>0.05），此現(xiàn)象可能與蘇姜豬有針對(duì)性的選擇培育有關(guān)，但在群體中未檢測(cè)到部分位點(diǎn)的純合型個(gè)體則可能與其他基因或性狀存在關(guān)聯(lián)影響，有待深入研究。

Lrh-I基因在動(dòng)物卵巢卵泡顆粒細(xì)胞和妊娠黃體細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控SR-BI，和CYPl9基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控雌激素的生物合成；敲除小鼠Lrh-I基因，可影響卵巢卵泡排卯功能。這些現(xiàn)象均表明Lrh-I因與動(dòng)物繁殖機(jī)能有重要相關(guān)性。本研究將Lrh-I基因引物Pl和P2擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型與蘇姜豬產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，不同SSCP類型與第1、2胎產(chǎn)仔數(shù)間均無(wú)顯著影響（P>O.05）。但從引物P1擴(kuò)增區(qū)4個(gè)堿基突變位點(diǎn)的雜合情況看，蘇姜豬第1胎SSCP一7型平均產(chǎn)仔數(shù)相對(duì)最低，為8.20±2.49頭，其4個(gè)堿基突變位點(diǎn)均為純合型，而其他SSCP型至少有1個(gè)堿基突變位點(diǎn)為雜合型，表明引物P1擴(kuò)增區(qū)相應(yīng)堿基突變位點(diǎn)的雜合可能有助于產(chǎn)仔數(shù)性狀的提升。引物P2擴(kuò)增區(qū)2種基因型在第1、2胎產(chǎn)仔數(shù)性狀上也未達(dá)到顯著差異水平（P>0.05），但相對(duì)而言，蘇姜豬AA型平均產(chǎn)仔數(shù)高于AB型，表明27423038位點(diǎn)堿基的突變可能不利于產(chǎn)仔數(shù)性狀的提升.