固相萃取-高效液相色譜法測定龍血竭含片中的龍血素A和B的含量

胡旭佳， 楊 娟

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650504)

龍血竭為龍舌蘭科植物劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)含脂木質部經提取加工制成的樹脂，常稱為“龍血竭”或“國產血竭“，它具有活血散瘀、消炎止痛、收斂止血、生肌斂瘡和補血益氣等功效，用于跌打損傷、淤血作痛、婦女氣血凝滯和外傷出血等的治療[1,2]，但在臨床上一直把龍血竭作為一種配方輔佐。近年來，隨著中藥劑型的不斷發(fā)展，其主要劑型為散劑、片劑、膠囊劑和滴丸等。龍血素A(Loureirin A)、B(Loureirin B)為其主要活性成分。目前文獻中關于龍血竭原藥材、膠囊、滴丸與片劑中龍血素A、B含量的測定已有一些報道，其主要檢測方法是毛細管電泳(CE)法和高效液相色譜(HPLC)法[3 - 10]，而關于龍血竭含片中的有效活性成分龍血素A、B含量的測定方法還未見報道。

本實驗采用固相小柱經凈化富集有效成分后，再通過HPLC法同時測定龍血竭含片中龍血素A、B的含量。該方法簡便、準確且重現(xiàn)性好，可為龍血竭含片的質量控制方法的研究提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)；Tu-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器公司)；CX250超聲波清洗器(北京醫(yī)療設備二廠)；C18固相萃取填料。

龍血素A對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111660-200402，供含量測定用)，龍血素B對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111558-200405供含量測定用)。取龍血素A、B對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成含龍血素A 80 μg/mL和龍血素B 60 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；其他試劑均為分析純，購于北京化學試劑廠。水為純凈水(杭州娃哈哈集團)。

龍血竭含片(批號：091001，091002，091101，091102，091201，091202，100101,100102，100201，100202)均由云南大唐漢方制藥公司提供。

1.2 樣品前處理

取適量龍血竭含片，研細，混勻，按照如下步驟制備樣品溶液。

1.2.1提取精密稱定研磨好的龍血竭含片粉末0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇水溶液，蓋緊瓶塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，得樣品提取液，待凈化。

1.2.2樣品的凈化固相萃取柱的制備：在10 mL固相萃取空柱管裝入3 g C18(200目)材料，輕輕敲打使填料均勻填充，其上下方均用壓實的脫脂紗布塞住。固相萃取步驟：使用前先用10 mL甲醇和10 mL水活化小柱，樣品液轉移入固相萃取柱，控制流速為1滴/秒過柱，最后用1 mL甲醇-水(90∶10，V/V)洗脫，接收液經0.22 μm有機濾膜過濾，以備測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特 kromasil C18(200×4.6 mm,5 μm)，流動相：乙腈-0.1%乙酸溶液(37∶63，V/V)為流動相；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

實驗對提取方法進行了研究，在實驗中將同一供試品(云河藥業(yè),批號：091001)分別用三氯甲烷、乙酸乙脂、乙腈-乙酸溶液(39∶61，V/V)和甲醇超聲提取。經比較發(fā)現(xiàn)三氯甲烷和乙酸乙脂超聲提取不完全，乙腈-乙酸溶液(39∶61，V/V)和甲醇超聲提取結果相近，為操作方便，故選擇甲醇超聲提取。

2.2 超聲時間的選擇

同一批號樣品(云河藥業(yè),批號：091001)以甲醇為提取溶劑，比較10、20、30、40、60、90和120 min等不同超聲時間的提取率。結果表明，提取30 min龍血素B提取率最高，龍血素A也基本提取完全，因此本實驗選擇甲醇超聲提取30 min。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

在其他條件不變的情況下，考察了依利特 kromasil C18(200×4.6 mm,5 μm)、漢邦 C18和Agilent C18(Zorbax Exlipse)(150×4.6 mm,5 μm)三種不同品牌的同類型色譜柱對測定結果的影響。實驗結果表明，采用以上三種色譜柱，樣品都可達到基線分離，不同品牌的同類型色譜柱，對被測成分色譜峰的分離度及測定結果無明顯影響。在其他條件不變的情況下，考察了流速對測定結果的影響，結果表明流速分別為0.9、1.0和1.2 mL/min時對被測成分色譜峰的分離度及測定結果無明顯影響。在其他條件不變的情況下，考察了柱溫對測定結果的影響，實驗結果表明，柱溫分別為25 ℃、30 ℃和40 ℃時，對被測成分色譜峰的分離度及測定結果無明顯影響。優(yōu)化后的色譜條件見1.3節(jié)。

2.4 系統(tǒng)適應性

按照上述優(yōu)化條件，選用kromasil C18 色譜柱，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。在該條件下對照品溶液和樣品溶液的龍血素A與龍血素B的色譜圖分離效果較好，如圖1所示。

2.5 方法的精密度、線性范圍、檢出限與定量限

取同一對照品標準系列溶液，在選定條件下進行分析，連續(xù)測定6次，以峰面積積分值測得龍血素A、B的精密度(RSD)。以峰面積積分值(Y)對對照品含量(X)進行回歸處理，得到的線性回歸方程；并以3倍信噪比(S/N=3)所對應的濃度為檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)對應的濃度為定量限(LOQ)，結果見表1。從表1可看出，龍血素A在0.1030～1.5450 μg，龍血素B在0.0426～0.6390 μg范圍內呈良好線性，相關系數(shù)均為1.0000。

表1 方法的精密度、線性范圍、檢出限及定量下限(n=6)

2.6 方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性

取同一樣品(大唐漢方,批號：091001)制備供試品溶液，分別在0、18、24、30、36、42和48 h進行測定，以峰面積計算，兩個成分的RSD分別為1.8%、1.0%,表明48 h內兩個成分在供試品溶液中基本穩(wěn)定。

精密稱取龍血竭含片(大唐漢方，批號：091001)，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，分別測定并計算含量，結果顯示6份樣品中龍血素A含量測定的平均值為1.8836 mg/g，RSD為1.2%，龍血素B含量測定的平均值為3.1220 mg/g，RSD為0.7%，證明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 回收率實驗

精密稱取已知含量的樣品(大唐漢方制藥，批號：091001，龍血素A含量為1.8836 mg/g，龍血素B含量為3.1220 mg/g) 6份，精密加入龍血素A 0.2920 mg，龍血素B 0.5080 mg，按本方法測定，計算得龍血素A回收率在98.52%～101.64%之間，平均回收率為99.86%，RSD為1.4%；龍血素B回收率在97.81%～101.77%之間，平均回收率為99.88%，RSD為1.3%。

2.8 實際樣品測定

分別取10批龍血竭含片(云南大唐漢方制藥公司)，按1.2節(jié)方法處理，按照1.3節(jié)進行分析，用標準曲線法分別計算10批樣品中兩種成分的含量，測定結果見表2，該結果符合中國藥典含量測定規(guī)定。本品按處方量計,同時考慮到不同產地來源的龍血竭原料影響因素，并根據(jù)上述10批樣品的實際測定結果，樣品1含龍血素A(C17H18O4)不得少于0.6 mg，龍血素B(C18H20O5)不得少于0.6 mg，總量不少于1.5 mg。

表2 樣品測定結果

3 結論

本文采用自制固相小柱結合高效液相色譜技術，實現(xiàn)了龍血竭含片中龍血素A、B的同時測定。方法的加標回收率為97.81%～101.77%，RSD為0.3%～0.5%，檢出限為0.0103～0.0043 μg，能夠滿足龍血竭含片中龍血素A、B的含量分析要求。方法簡便快速，結果可靠，在一定程度上為龍血竭含片中龍血素A、B的質量控制提供了新方法。