HPLC法同時測定不同產(chǎn)地香附藥材中香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮

王世宇， 李文兵， 盧君蓉*， 季寧平， 傅超美， 嚴(yán) 鑫， 劉哿咿， 余佳麗

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川　成都　611137；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川　成都　611900）

HPLC法同時測定不同產(chǎn)地香附藥材中香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮

王世宇1， 李文兵2， 盧君蓉1*， 季寧平1， 傅超美1， 嚴(yán) 鑫1， 劉哿咿1， 余佳麗1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川成都611900）

目的 建立HPLC法同時定量測定香附中3種特征性成分香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮，并對不同產(chǎn)地香附樣品進(jìn)行測定。方法 香附甲醇提取液的分析采用Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm），流動相為甲醇-水（68∶32），檢測波長為242 nm，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30℃。結(jié)果 香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮進(jìn)樣量分別在0.260～0.912μg、0.028～0.098μg、0.082～0.286μg內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.3%（RSD為1.5%）、97.9%（RSD為2.0%）、99.1%（RSD為1.4%）。海南、廣東、廣西、四川省的11批香附中香附烯酮為1.52～4.80 mg/g、圓柚酮為0.04～0.20 mg/g、α-香附酮為0.70～1.99 mg/g。結(jié)論 同一產(chǎn)地香附中3種成分含有量均呈現(xiàn)香附烯酮＞α-香附酮＞圓柚酮的規(guī)律。

香附；香附烯酮；圓柚酮；α-香附酮；高效液相色譜法

香附為莎草科植物莎草C yperus rotundus L.的干燥根莖，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛之功效，臨床上常用于治療肝郁氣滯、胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳房脹痛等癥［1］，被歷代醫(yī)家譽為“氣病之總司，女科之主帥”。

香附主要含有揮發(fā)油類成分，如多種單萜、倍半萜及其氧化物，此外，還有黃酮類、三萜類、生物堿、蒽醌、酚類等化合物［2-3］?！吨袊幍洹?010年版一部對香附藥材及飲片的質(zhì)量控制僅以揮發(fā)油的量為指標(biāo)，缺乏有效成分的定量測定［4］，而國內(nèi)對于香附質(zhì)量控制的研究報道多以α-香附酮、香附中某一種黃酮成分或者總黃酮為評價指標(biāo)，難以控制其藥材及飲片的質(zhì)量［5-6］。香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮為香附中含有量相對較高且藥效活性明顯的3種特征性成分，對于評價香附的質(zhì)量具有非常重要的意義［7-10］。本實驗采用HPLC法建立同時測定香附藥材中香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮含有量的方法，并用于11個不同產(chǎn)地香附藥材中3種成分的測定，為進(jìn)一步評價不同產(chǎn)地香附藥材的質(zhì)量和完善香附的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

Agilent1200 Series高效液相色譜儀（G1312B四元梯度泵、G1322A脫氣機、G1316B柱溫箱、G1329B自動進(jìn)樣器、G1315C二極管陣列紫外檢測器），賽多利斯Bp211DAG電子天平（德國Sartorius公司），超聲波清洗器KQ5200DB（昆山市超聲儀器有限公司）。

圓柚酮對照品（購于美國Sigma公司，批號10112423，純度＞98%），香附酮（購于江西本草天工科技有限責(zé)任公司，批號1443-080529，純度≥98%），香附烯酮（自制，純度＞98%）。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。不同產(chǎn)地的藥材從各產(chǎn)地收集，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為莎草科植物莎草C yperus rotundus L.的干燥根莖。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（68∶32）；檢測波長為242 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30℃。在選定條件下，各色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達(dá)基線分離，其理論塔板數(shù)均大于4 000，見圖1。

2.2對照品溶液的制備 取香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮對照品適量，精密稱定，置于50 mL量瓶內(nèi)，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，得混合對照品貯備液，質(zhì)量濃度分別為0.651 2、0.070 2、0.200 4 mg/mL。精密量取上述貯備液1 mL，置10 mL量瓶內(nèi)，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，得對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為65.12、7.02、20.04 μg/mL。

圖1　香附的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatographs of Cyperus rotundus L.

2.3供試品溶液的制備 取香附粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，分別進(jìn)樣4、6、8、10、12、14μL，測定各色譜峰峰面積。以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1　3種特征性成分的線性范圍考察Tab.1 Linear range of three characteristic constituents

2.5精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮峰面積，其RSD分別為0.9%、0.7%、1.0%，表明儀器的精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，分別按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計算。香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮含有量RSD分別為1.3%、1.0%、1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計算。香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮RSD分別為1.4%、1.3%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗 取6份已知含有量的樣品（廣西欽州）約0.25 g，精密稱定，分別加入對照品貯備液1 mL。按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2　香附中3種特征性成分加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for three characteristic constituents in Cyperus rotundus L.

2.9樣品測定 取不同產(chǎn)地的香附藥材，用本實驗所確定的方法進(jìn)行樣品處理和成分定量測定，結(jié)果見表3。

由表3可知，在實驗所取11批不同產(chǎn)地的香附藥材中均能同時檢測香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮3種特征性成分的量，并且不同產(chǎn)地香附中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮的含有量差異較大，其中香附烯酮為1.52～4.80 mg/g、圓柚酮為0.04～0.20 mg/g、α-香附酮為0.70～1.99 mg/g；同一產(chǎn)地的香附中3種成分的含有量也不同，且均呈現(xiàn)如下規(guī)律：香附烯酮量＞α-香附酮量＞圓柚酮量。

表3　不同產(chǎn)地香附藥材中3種特征性成分測量結(jié)果Tab.3 M easurement results of three characteristic constituents in Cyperus rotundus L.from different growing areas

3　討論與展望

3.1中藥具有多成分、多靶點整體作用的特點，為使香附樣品中各種成分都能達(dá)到較好的分離效果，在課題組前期研究和文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上［11-12］，進(jìn)一步對流動相、柱溫、檢測波長等進(jìn)行了系統(tǒng)考察，最終確定色譜條件為：Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇-水（68∶32），檢測波長為242 nm，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30℃。在該條件下香附中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮分離度良好，重復(fù)性好，且測定簡便，可以用于樣品中此3種成分測定。

3.2香附所含成分復(fù)雜，課題組在前期研究中運用GC-MS技術(shù)對香附揮發(fā)油所含成分進(jìn)行初步研究［10］，在香附生品的揮發(fā)油中得到共有峰52個，并鑒定了其中46個峰，包括α-香附酮、圓柚酮、香附子烯、香附烯酮等成分。研究提示單用α-香附酮或者香附中所含的在自然界中分布廣泛的木犀草素等黃酮類成分難以準(zhǔn)確表征香附特征，更無法準(zhǔn)確評價香附的質(zhì)量。故課題組進(jìn)一步篩選條件，從香附藥材中分離制得香附烯酮對照品，并通過碳譜、氫譜及質(zhì)譜研究確定其結(jié)構(gòu)，采用HPLC法測定其純度，便于定量測定之用。

通過對11批不同產(chǎn)地香附藥材的測定進(jìn)一步證實，香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮確為香附所含的3種特征性成分，并且同一產(chǎn)地香附中3種成分的含有量還具有一定的規(guī)律性。本研究結(jié)果對于香附的質(zhì)量評價具有重要的意義，為進(jìn)一步完善香附的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)，也為下一步深入研究香附疏肝解郁的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機理提示了方向。

［1］ 王世宇，盧君蓉，陳秋薇，等.香附炮制的歷史沿革及現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中藥與臨床，2012，2（6）：62-64.

［2］ 徐 燕，李大祥，凌鐵軍，等.香附化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：214-218.

［3］ 馮毅凡，郭曉玲，孟 青，等.香附超臨界CO2萃取物化學(xué)成分分析［J］.中藥材，2006，29（3）：232-235.

［4］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：241.

［5］ 侯立靜，吳麗麗，李英霞.不同產(chǎn)地香附和醋炙香附中α-香附酮含量測定［J］.陜西中醫(yī)，2011，32（4）：480-481.

［6］ 李英霞，陸永輝，馮 文，等.HPLC測定不同產(chǎn)地香附及醋炙香附中木犀草素的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：56-58.

［7］ Xu Y，Zhang H W，Wan X C，et al.Complete assignments of1H and13C NMR data for two new sesquiterpenes from Cyperus rotundus L.［J］.Magn Reson in Chem，2009，47（6）：527-531.

［8］ Tsoyi K，Jang H J，Lee Y S，et al.（+）-Nootkatone and（+）-valencene from rhizomes of Cyperus rotundus increase survival rates in septicmice due to heme oxygenase-1 induction［J］.JEthnopharmacol，2011，137（3）：1311-1317.

［9］ Meena A K，Yadav A K，Niranjan U S，etal.Review on Cyperus rotundus-A potential herb［J］.Int JPharm Clin Res，2010，2（1）：20-22.

［10］ 盛菲亞，盧君蓉，彭 偉，等.香附炮制前后揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜對比研究［J］.中草藥，2013，44（23）：3321-3327.

［11］ 盧君蓉，王世宇，傅超美，等.香附醋制工藝的優(yōu)化研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35（1）：70-73.

［12］ 侯曉虹，李 巖，唐 星，等.HPLC法測定香附二氧化碳超臨界液體萃取物中α型β-香附酮與香附烯酮含量［J］.沈陽藥物大學(xué)學(xué)報，2006，23（6）：373-375.

［13］ 李興華，胡昌江，李文兵，等.益智藥材中圓柚酮含量的高效液相色譜法測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）：49-50.

Determ ination of cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone in Cyperus rotundus L.from different grow ing areas by HPLC

WANG Shi-yu1， LIWen-bing2， LU Jun-rong1*， JINing-ping1， FU Chao-mei1， YAN Xin1， LIU Ge-yi1， YU Jia-li1
（1.Chengdu Uniυersity of TCM，Chengdu 611137，China；2.Neo-Green Pharmaceutical Co.，Ltd，Chengdu 611900，China）

AIM To establish an HPLC determination for three characteristic constituents，cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone，in Cyperus rotundus L.from differentgrowing areas.METHODS Phenomenex C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）was used with themobile phase consisting ofmethanol-water（68∶32）at a flow of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 242 nm and column temperature wasmaintained at 30℃.RESULTS The good linear relationship of cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone were in the range of 0.260-0.912μg、0.028-0.098μg，and 0.082-0.286μg，respectively.The average recoverieswere 98.3%（RSD 1.5%），97.9%（RSD 2.0%），and 99.1%（RSD 1.4%），respectively.The cyperotundone content fell within 1.52-4.80 mg/g，the nootkatone content within 0.04-0.20 mg/g，and theα-cyperone content within 0.70-1.99 mg/g in eleven batches collected from Hainan，Guandong，Guanxi，and Sichuan Province，China. CONCLUSION The method presents a content pattern，cyperotundone＞nootkatone＞α-cyperone，in Cyperus rotundus L.from the same growing area.

Cyperus rotundus L.；cyperotundone；nootkatone；α-cyperone；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0588-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.028

2014-03-04

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81303227）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（ZRQN1412）

王世宇（1974—），女（回族），博士，副教授，從事中藥新制劑、新劑型與中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：13708051074，E-mail：497217505@qq.com

盧君蓉（1988—），女，碩士，助教，從事中藥新制劑、新劑型與中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：13688167921，E-mail：634589580@qq.com