香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌的體外抗真菌作用研究

王 潔， 唐春萍*， 江 濤，2， 沈志濱， 陳艷芬， 黃奕曦

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東　廣州　510006；2.廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東　廣州　510006）

香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌的體外抗真菌作用研究

王 潔1， 唐春萍1*， 江 濤1，2， 沈志濱1， 陳艷芬1， 黃奕曦1

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東廣州510006）

目的 研究香鱗毛蕨Dryopteris Fragrans有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌的體外抗真菌作用，進(jìn)一步明確香鱗毛蕨有效部位的抗菌譜。方法 用紙片法、試管內(nèi)藥基法、微量液基稀釋法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌2株標(biāo)準(zhǔn)株和4株臨床分離菌株的抑菌圈及最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。結(jié)果 不同質(zhì)量濃度香鱗毛蕨有效部位貯備液對(duì)糠秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株抑菌圈的大小分別為6.7～19.6 mm、6.8～17.1 mm；試管內(nèi)藥基法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌的MIC，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC為10 mg生藥/mL，對(duì)臨床分離株MIC為5～10 mg生藥/mL；微量液體稀釋法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌的MIC，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC為1.56～3.13 mg生藥/mL，對(duì)臨床分離株MIC為3.13 mg生藥/mL。結(jié)論 香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌有抑菌作用。

香鱗毛蕨；糠秕馬拉色菌；最低抑菌質(zhì)量濃度；體外抑菌

馬拉色菌（Malassezia）又稱為糠秕孢子菌（Pityrosporum），是人體或者其他動(dòng)物皮膚上可分離出的正常菌群，可分為7種：糠秕馬拉色菌（M.furfur）、球形馬拉色菌（M. globosa）、合軸馬拉色菌（M.sympodialis）、限制馬拉色菌（M.restricta）、斯洛菲馬拉色菌（M.slooffiae）、鈍性馬拉色菌（M.obtusa）、厚皮馬拉色菌（M.pachydermatis），其中除了厚皮馬拉色菌外，其余都是嗜脂性的真菌。糠秕馬拉色菌（M.furfur）為馬拉色菌的一種，是一種條件致病菌，可引起花斑癬、脂溢性皮炎、糠秕孢子菌性毛囊炎、糠秕孢子菌性真菌血癥、甲真菌病及銀屑病等疾?。?］。隨著抗生素、皮質(zhì)激素等藥物的長(zhǎng)期濫用以及器官移植、慢性感染、營(yíng)養(yǎng)不良等因素的影響，與糠秕馬拉色菌有關(guān)的疾病呈上升趨勢(shì)，而治療這類疾病的藥物非常有限［2-3］。民間驗(yàn)方利用香鱗毛蕨治療皮癬等皮膚病已有幾十年的歷史。也有學(xué)者證實(shí)了香鱗毛蕨對(duì)皮膚病治療方面的作用［4-5］。范華倩等［7］對(duì)香鱗毛蕨有效部位進(jìn)行了研究，證明了香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌等均有抑菌作用，但尚未有香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌抑菌作用的研究，本實(shí)驗(yàn)采用3種體外抑菌試驗(yàn)方法，旨在研究香鱗毛蕨有效部位對(duì)M.furfur的抑菌作用。

1　材料與儀器

1.1菌株 菌株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌科?？凤躐R拉色菌（M.furfur）共6株，其中標(biāo)準(zhǔn)株2株（菌株編號(hào)分別為CBS1878、CBS7019），臨床分離株4株（菌株編號(hào)分別為3750、3796、3809、3808）；近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株1株（編號(hào)ATCC22019）。

1.2藥物與試劑 香鱗毛蕨采自黑龍江省五大連池，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定為鱗毛蕨屬類植物香鱗毛蕨。

氟康唑純度為99.4%，壽光富康制藥有限公司，批號(hào)A-10511211001。

麥芽浸膏（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）、酵母浸膏（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；吐溫80（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；單硬脂酸甘油酯（江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司）；葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蛋白胨（MBCHEM）；玉米油（豐益貿(mào)易私人有限公司）；瓊脂（廣州瑞舒生物科技有限公司）。

1.3主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；電熱手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XSP-10C生物顯微鏡（上海永享光學(xué)儀器制造有限公司）；pH計(jì)（賽多利斯股份有限公司）；微波爐（美的微波爐公司廣州分公司）。

2　方法

2.1香鱗毛蕨有效部位的制備 香鱗毛蕨有效部位由廣東藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室制備，通過取香鱗毛蕨地上部分經(jīng)乙醇提取并富集純化后制得，其主要物質(zhì)成分為間苯三酚類化合物，經(jīng)紫外測(cè)定，總間苯三酚含有量達(dá)到50%以上，香鱗毛蕨有效部位貯備液質(zhì)量濃度：2 g生藥/mL。

2.2瓊脂擴(kuò)散法［6］

2.2.1馬拉色固體培養(yǎng)基的配制 取20 g麥芽浸膏，2 g酵母浸膏，2 m L吐溫80，2.5 g單硬脂酸甘油酯，40 g葡萄糖，10 g蛋白胨，20 mL玉米油，20 mL瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水，將其pH調(diào)至5.6，加熱溶解，分裝后121℃高壓滅菌15 min。

2.2.2菌液制備 將受試的菌株接種于馬拉色固體培養(yǎng)基斜面，32℃連續(xù)傳代培養(yǎng)2次。第2次傳代培養(yǎng)2 d后，用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，其菌懸液濃度大致?× 106～5×106cfu/mL，備用。

2.2.3含藥紙片的制備 取中速濾紙，用打孔器打出直徑為6 mm濾紙片，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后烤干用。將紙片在2 g生藥/mL、1 g生藥/mL、0.5 g生藥/mL的香鱗毛蕨有效部位藥液中浸泡30 min后取出。

2.2.4抑菌活性的測(cè)定 用無菌棉棒將“2.1.1”項(xiàng)制成的菌液均勻涂布在馬拉色固體培養(yǎng)基平板上，將不同濃度藥液的藥片貼于培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使其接觸良好。置于32℃溫箱培養(yǎng)2 d，用刻度尺測(cè)量抑菌圈直徑的大小。各株糠秕馬拉色菌按以上操作平行重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算抑菌圈平均直徑與標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3試管內(nèi)藥基法［7］用馬拉色固體培養(yǎng)基將香鱗毛蕨有效部位貯備藥液倍比稀釋，質(zhì)量濃度依次為1 600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125生藥mg/mL。取編號(hào)為1～12號(hào)的無菌試管12支，將上述各質(zhì)量濃度含藥培養(yǎng)基分別加入1～10號(hào)試管中，每支0.3 mL，再分別加入2.7 mL培養(yǎng)基，混合搖勻。11～12號(hào)試管中各加無藥培養(yǎng)基3 mL。然后向1～10支試管分別加入菌液50μL。11號(hào)管不加菌液，為陰性對(duì)照；12號(hào)管不加藥液，為生長(zhǎng)對(duì)照。然后將1～12號(hào)試管置于32℃溫箱中培養(yǎng)2周。以無糖秕馬拉色菌生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度的試管為香鱗毛蕨有效部位的MIC值。

2.4微量液基稀釋法［8］

2.4.1馬拉色液體培養(yǎng)基配制 取麥芽浸膏20 g，酵母浸膏2 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，玉米油20 mL，加入蒸餾水1 000 mL，調(diào)整其pH至5.6，加熱溶解。分裝后，121℃高壓滅菌15 min。

2.4.2藥液的制備 將香鱗毛蕨有效部位貯備液用馬拉色液體培養(yǎng)基稀釋10倍，質(zhì)量濃度為200 mg生藥/mL。

2.4.3菌液的制備 將“2.1.1”項(xiàng)的菌液用馬拉色液體培養(yǎng)基稀釋100倍，備用。糖秕馬拉色菌的菌液濃度為1× 104～5×104cfu/mL。

2.4.4藥液加樣及結(jié)果判讀 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）制定的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法。取96微量孔板，第1列加入200μL藥液，第2列至第11列加入馬拉色液體培養(yǎng)基100μL；按照倍比稀釋的方法，從每一行第1孔吸出100μL藥液加入相應(yīng)的第2孔，混合均勻后，從第2孔吸出100μL藥液加入相應(yīng)的第3孔，以此類推，至第10孔混合均勻后，將吸出的100μL藥液舍棄。每孔第1列至第11列加“2.3.3”項(xiàng)的菌液100μL。每排第11列為生長(zhǎng)對(duì)照，第12列作為陰性對(duì)照。將96微量孔板置32℃溫箱中培養(yǎng)2 d。取無糖秕馬拉色菌生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度即為DF有效部位的MIC值。在每次測(cè)定時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控（QC）株采用近平滑念珠菌（ATCC 22019），質(zhì)控陽性藥物為氟康唑，在平行操作條件下，QC株的MIC應(yīng)在0.12～0.5μg/mL范圍內(nèi)，則視為測(cè)定結(jié)果有效可信。

3　結(jié)果

3.1紙片法 香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株紙片法抑菌圈結(jié)果見表1，表2。從表1可見，香鱗毛蕨有效部位高、中、低劑量均出現(xiàn)抑菌圈，表明香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床分離株均有抑菌作用。

表1　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈直徑（mm）（±s）

表1　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈直徑（mm）（±s）

注：“-”表示無抑制作用

7019香鱗毛蕨有效部位組別質(zhì)量濃度/（g生藥/mL）抑菌圈直徑/mm菌株編號(hào)1878菌株編號(hào)16.9±2.9 19.6±0.8香鱗毛蕨有效部位1 13.0±4.6 16.8±0.8香鱗毛蕨有效部位0.5 8.0±1.2 9.1±3.9陰性對(duì)照0 2——

表2　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌臨床分離菌株抑菌圈直徑（mm）（±s）

表2　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌臨床分離菌株抑菌圈直徑（mm）（±s）

注：“-”表示無抑菌作用

3808香鱗毛蕨有效部位組別質(zhì)量濃度/（g生藥/mL）抑菌圈直徑/mm菌株編號(hào)3750菌株編號(hào)3796菌株編號(hào)3809菌株標(biāo)號(hào)14.6±1.9 10.5±2.7 14.9±3.6 17.1±2.7香鱗毛蕨有效部位1 8.6±2.3 9.3±1.9 10.3±1.9 14.5±1.7香鱗毛蕨有效部位0.5 8.6±2.5 9.0±1.8 7.9±1.7 6.8±1.2陰性對(duì)照0 2————

3.2試管內(nèi)藥基法 采用試管內(nèi)藥基法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌的MIC值，結(jié)果見表3、表4。試管內(nèi)藥基法的體外敏感試驗(yàn)中，糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在第6管開始有菌落生長(zhǎng)，糖秕馬拉色菌臨床分離株在第6管至第7管有菌落生長(zhǎng)。所以糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC值：10 mg生藥/mL；糖秕馬拉色菌臨床分離菌株MIC值范圍在5～10 mg生藥/mL。

表3　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的M IC

表4　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌臨床分離株的M IC值

3.3微量液基稀釋法 香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌的MIC值如表5、表6所示。標(biāo)準(zhǔn)菌株在第8列開始有菌落生長(zhǎng)；臨床分離株在第7列開始有菌落生長(zhǎng)。所以，糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC：1.56mg生藥/mL，糖秕馬拉色菌臨床分離株MIC：3.13mg生藥/mL。標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值較臨床分離株的MIC值低。

表5　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的M IC值

表6　香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌臨床分離菌株的M IC值

4　討論

糖秕馬拉色菌為一種腐生寄生菌，為馬拉色菌的一種，可引起花斑癬、糖秕馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、銀屑病等，在馬拉色菌屬中屬于重要的致病菌。與糖秕馬拉色菌相關(guān)的疾病中常存在區(qū)別感染的問題，感染不同的部位會(huì)引發(fā)出不同的疾病，如花斑癬易發(fā)于全身、脂溢性皮炎易發(fā)于面部、軀干上部、毛囊炎易發(fā)于軀干上部、頸部、雙臂等［9］；且同一種疾病可以分離出兩種以上馬拉色致病菌；糖秕馬拉色菌感染的疾病亦存在地域的差異，在國(guó)內(nèi)，李志瑜等［10］調(diào)查表明導(dǎo)致花斑癬的菌種主要為M.sympodialis及糖秕馬拉色菌，而在國(guó)外，Grespo等［11］從花斑癬中分離的菌種主要為糖秕馬拉色菌；這些都為糖秕馬拉色菌相關(guān)疾病的治療帶來了許多問題。目前治療這些疾病的方法主要是使用化學(xué)合成藥物，其中特異性抗真菌藥物包括唑類藥物最常用，但這些化學(xué)藥物復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生耐受且毒副作用大。因此，尋找作用安全，療效滿意，且價(jià)格合理的抗糖秕馬拉色菌藥物的任務(wù)仍然很艱巨［12］。中藥副作用小，很少出現(xiàn)耐藥有利于疾病的長(zhǎng)期和預(yù)防治療；且利用現(xiàn)代化工藝從天然中草藥中分離有效的抗真菌成分的技術(shù)越來越成熟，使中藥的開發(fā)應(yīng)用有良好的前景。

1992年美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推出了M27（酵母菌液體培養(yǎng)基稀釋法抗真菌藥敏感試驗(yàn)）系列方案，規(guī)范酵母菌的藥敏試驗(yàn)。也有學(xué)者［13-14］通過試管內(nèi)藥基法、微量液體稀釋法測(cè)定中藥對(duì)馬拉色菌的MIC值，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于馬拉色菌的研究仍沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果也受到爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)參照了其中的M27-A（酵母菌微量稀釋法抗真菌敏感試驗(yàn)）的實(shí)驗(yàn)方法，并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，用馬拉色液體培養(yǎng)基代替RPMI1640以提供糖秕馬拉色菌生長(zhǎng)所需的油脂，結(jié)果表明糖秕馬拉色菌可以在馬拉色培養(yǎng)基上良好的生長(zhǎng)。

紙片法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果清晰易讀，成本較低，但此方法易受許多因素干擾［15］。試管內(nèi)藥基法屬于大量稀釋法的一種，準(zhǔn)確性較佳，重復(fù)性也較好，但是由于真菌的生長(zhǎng)部分受抑制出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，可能會(huì)導(dǎo)致某些藥物的終點(diǎn)判斷困難［16］。NCCLS頒布的一系列微量稀釋法，可以用微量的液體準(zhǔn)確地測(cè)定出藥物的MIC值。此法在微量孔中進(jìn)行，操作方便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性高。有文獻(xiàn)報(bào)道采用多量法與微量法實(shí)驗(yàn)時(shí)，所得的MIC在兩個(gè)濃度梯度內(nèi)，都認(rèn)為結(jié)果一致［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過試管內(nèi)液基法與微量液體稀釋法測(cè)得6株糠秕馬拉色菌的MIC值，其中糖秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值分別為10 mg生藥/mL、1.56～3.13 mg生藥/mL；臨床分離株的MIC值分別為5～10 mg生藥/mL、3.13 mg生藥/mL，兩種方法測(cè)得的6株糖秕馬拉色菌菌株MIC值均在兩個(gè)濃度梯度內(nèi)，具有一致性，一致率達(dá)100%。本實(shí)驗(yàn)3種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果都證明了香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌有抑菌作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的3種方法均可用來作為評(píng)價(jià)香鱗毛蕨有效部位對(duì)糠秕馬拉色菌抑菌作用，為馬拉色菌體外抑菌試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化提供了參考，也為深入進(jìn)行香鱗毛蕨有效部位對(duì)糖秕馬拉色菌的抑菌機(jī)制、整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供依據(jù)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0642-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.041

2014-05-15

科技部“十二五”重大新藥創(chuàng)制（2011ZX09102-007-03）；廣東省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010B030700044，2011A030100013）；2010年廣東省教育廳高層人才資助項(xiàng)目；廣州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（12A062131631）

王 潔（1989—），女，碩士生，從事中藥有效成分研究和新藥開發(fā)。E-mail：296885242@qq.com

唐春萍（1966—），女，教授，從事中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究。E-mail：tchp66@163.com