蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠的治療作用

段賢春， 汪永忠， 方朝暉， 吳 健， 高家榮， 羅 歡， 夏倫祝

（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽　合肥　230031）

蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠的治療作用

段賢春， 汪永忠， 方朝暉*， 吳 健， 高家榮， 羅 歡， 夏倫祝

（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥230031）

目的 觀察蓯歸益腎膠囊（肉蓯蓉、當歸、山茱萸、桂枝、澤瀉、丹皮）對糖尿病腎病模型大鼠的治療作用。方法 120只SD大鼠隨機分為6組，蓯歸益腎膠囊高、中、低劑量組，厄貝沙坦陽性對照組，模型組和正常組，每組20只。采用STZ腹腔注射建立糖尿病腎病大鼠模型。分組造模后灌胃給藥4周，檢測空腹血糖、24 h尿微蛋白量、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、腎組織血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）、血管緊張素Ⅱ受體結(jié)合蛋白（AGTRAP）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達等指標。結(jié)果 經(jīng)蓯歸益腎膠囊治療4周后，大鼠24 h尿蛋白、空腹血糖及AngⅡ的水平均明顯低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論 蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠有一定的治療作用，其可能機制是抑制了大鼠的炎癥反應(yīng)，與抑制大鼠腎組織中AT1R、AGTRAP、CTGF的表達，降低AngⅡ的水平有關(guān)。

蓯歸益腎膠囊；糖尿病腎病；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）；血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）；血管緊張素Ⅱ受體結(jié)合蛋白（AGTRAP）；結(jié)締組織生長因子（CTGF）；大鼠

蓯歸益腎膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的醫(yī)院制劑，是治療糖尿病腎病的有效方，具有溫陽、滋陰、固腎之功效，在臨床上常用于治療糖尿病并發(fā)癥。

本研究通過動物實驗觀察蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的治療作用，為其新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　實驗材料

1.1實驗動物 成年SD大鼠，120只（60只雌性大鼠和60只雄性大鼠），體質(zhì)量200～250 g，大鼠身體健康，毛色正常，無生病、殘疾、細菌感染等病態(tài)情況。實驗前期，將大鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗期間飼喂顆粒飼料、自由飲水。

飼養(yǎng)環(huán)境：動物房為12 h光照、12 h黑暗，相對濕度為50%～70%，室溫為18℃～22℃。

1.2實驗藥物 蓯歸益腎膠囊，由本院制劑中心提供，生產(chǎn)批號20130925。處方組成包括肉蓯蓉、當歸、山茱萸、桂枝、澤瀉、丹皮等。具溫陽滋陰固腎之作用，用于治療陰陽兩虛之消渴病。每瓶裝膠囊36粒，每粒裝藥0.4 g，臨床用法用量：口服，成人1次3～5粒，每日3次。

厄貝沙坦片（即陽性對照藥），商品名為吉加，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，產(chǎn)品批號12082951，規(guī)格0.15 g/粒，適應(yīng)癥：高血壓病。用法用量：口服，推薦起始劑量為0.15 g，1日1次，根據(jù)病情可增加至0.3 g，1日1次。

1.3實驗儀器及試劑 TGL-18R冷凍離心機（黑馬儀器公司）；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；普通PCR儀（美國ABI公司，型號ABI2720）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司，型號ABI7500）。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，批號00058391）；Trizol Reagent（Invitrogen公司，批號97752639）；引物及探針合成（Invitrogen公司，批號96715982）；DEPC（Ruibio公司，批號20130527）；熒光定量試劑及實驗耗材（TaKaRa公司）。

2　實驗方法

2.1造模 適應(yīng)性飼喂1周后禁食12 h，將鏈脲佐菌素（STZ）溶于檸檬酸緩沖液（pH 4.8），除空白對照組外，各模型組大鼠腹腔注射STZ（50 mg/kg）制備糖尿病腎病模型。給藥后72 h尾靜脈取血，應(yīng)用血糖儀檢測模型大鼠空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），血糖值大于16.7 mmol/L、伴有尿量增多、飲食增多者為糖尿病腎病造模成功。

2.2分組及給藥 120只成年的糖尿病腎病大鼠（即60只雌性大鼠和60只雄性大鼠），雌雄各半，隨機分為6組，每組20只（包括10只雄性大鼠和10只雌性大鼠），分別為：蓯歸益腎膠囊高、中、低劑量組；厄貝沙坦陽性對照組；模型組；正常組。每組大鼠用苦味酸溶液按照頭、背、尾、四肢等相應(yīng)部位做好標記。

按照人和大鼠間體表面積折算的等效劑量比值（0.018）計算大鼠給藥量，最終確定蓯歸益腎膠囊高劑量組0.258 2 g/（100 g·d），蓯歸益腎膠囊中劑量組0.129 6 g/（100 g·d），蓯歸益腎膠囊低劑量組0.064 8 g/（100 g·d），厄貝沙坦陽性對照組0.001 35 g/（100 g·d），正常組給以等劑量的蒸餾水。采用灌胃給藥的方法，每日灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

2.3標本采集 實驗結(jié)束前1 d，用代謝籠收集與計量模型大鼠24 h尿量。藥物干預結(jié)束后用5%水合氯醛溶液0.7 mL/100 g腹腔注射（ip）麻醉，待4～5 min大鼠被麻醉后，稱定質(zhì)量，腹腔主動脈取血，分離血清，-70℃保存?zhèn)溆?；取腎臟，去包膜擦洗后精密電子天平稱定質(zhì)量，并取右腎放于凍存管中，置于液氮罐中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4觀察指標 （1）取24 h尿液測24 h尿蛋白量；（2）取血清測定大鼠空腹血糖（FBG）；（3）大鼠血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）的水平；（4）測定血管緊張素Ⅱ受體結(jié)合蛋白（AGTRAP），結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF），腎組織血管緊張素Ⅱ受體1（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）的表達。

2.5檢測方法

2.5.1測定大鼠24 h尿微蛋白量 取適量模型大鼠尿液于離心機3 000 r/min離心5 min，取上清液，應(yīng)用蛋白分析儀檢測模型大鼠24 h尿微蛋白量，由我院檢驗中心代測。

2.5.2檢測大鼠空腹血糖（FBG） 采用HITACHI 7600-P1模塊全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖（FBG）水平，由我院檢驗中心代測。

2.5.3測定大鼠腎臟AngⅡ的水平 采用ELISA法測定模型大鼠腎臟AngⅡ的水平，由安徽中醫(yī)藥大學實驗中心代測。

2.5.4檢測模型大鼠腎組織CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表達 應(yīng)用RT-PCR法檢測大鼠腎組織CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表達變化，由安徽中醫(yī)藥大學實驗中心代測。

2.6統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，兩組間運用單因素方差法進行分析。

3　實驗結(jié)果

3.1大鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿微蛋白量 與模型組相比，正常組大鼠空腹血糖24 h尿微蛋白低于模型組大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白量，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各給藥組大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白均低于模型組大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

與陽性藥組相比，模型組大鼠空腹血糖和24 h尿微蛋白均顯著偏高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；低劑量組大鼠24 h尿微蛋白高于陽性藥組大鼠24 h尿微蛋白量，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠FBG、24 h尿微蛋白的影響（±s）Tab.1 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats FBG and 24 h urine m icro p rotein（±s）

表1　蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠FBG、24 h尿微蛋白的影響（±s）Tab.1 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats FBG and 24 h urine m icro p rotein（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別動物數(shù)/只FBG/（mmol·L-1）24 h尿微蛋白/（mg/24 h）正常組10 10.702±0.815**15.109±3.199**模型組8 26.960±5.985△△41.983±8.891△△低劑量組9 15.565±5.212**27.274±6.134**△中劑量組10 12.808±5.317**25.526±8.815**高劑量組9 11.385±2.666**23.751±5.522**陽性藥組10 11.201±8.412**22.126±2.378**

3.2大鼠腎臟AngⅡ的水平 與模型組相比，蓯歸高劑量組、正常組大鼠腎臟AngⅡ的水平偏低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與模型組相比，陽性藥組大鼠腎臟AngⅡ的水平明顯偏低，具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

與陽性藥組相比，蓯歸高劑量組、正常組大鼠腎臟AngⅡ的水平偏高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），蓯歸中劑量組、蓯歸低劑量組、模型組大鼠腎臟AngⅡ的水平明顯偏高，有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠腎臟AngⅡ的影響（±s）Tab.2 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats AngⅡ（±s）

表2　蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠腎臟AngⅡ的影響（±s）Tab.2 Effect of Conggui Yishen Capsules on diabetic nephropathy in rats AngⅡ（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別動物數(shù)/只AngⅡ/（ng·L-1）正常組10 94.487±10.327△*模型組8 110.304±13.721△△低劑量組9 102.609±15.345△△中劑量組10 100.484±15.288△△高劑量組9 96.006±18.248△*陽性藥組10 80.157±15.019**

3.3RT-PCR檢測大鼠腎組織CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R的表達 利用實時熒光定量儀（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System）定量分析以上指標，所測Ct值見表3。

本次實驗所使用的分析方法為：相對定量研究（relative quantification study）。分析所采用的指標為：2-ΔΔCt，即由Ct值得出各組相對定量值（Relative Quantification，RQ）后（RQ=2-ΔΔCt），在計算機上得出如下各分析圖譜，即柱狀圖1～3所示。

表3　蓯歸益腎膠囊對模型大鼠腎臟CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表達影響（Ct值，±s）Tab.3 Im pact of Conggui Yishen Capsules of rat kidney AT1R，AGTRAP and CTGF（Ct，±s）

表3　蓯歸益腎膠囊對模型大鼠腎臟CTGF mRNA，AGTRAP，AT1R表達影響（Ct值，±s）Tab.3 Im pact of Conggui Yishen Capsules of rat kidney AT1R，AGTRAP and CTGF（Ct，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05

組 別CTGFmRNA AGTRAP AT1R正常組20.116±0.198 22.126±0.979**26.151±0.595*△模型組20.894±0.183 17.108±0.592 19.957±0.411低劑量組20.132±0.209 18.967±0.794 22.187±0.503中劑量組20.769±0.313*△18.870±1.823 20.986±0.357高劑量組20.326±0.197*18.056±0.537△22.243±0.671△陽性藥組19.851±0.279 18.959±0.938 20.787±0.287

4　討論

糖尿病腎病是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一，亦稱糖尿病性腎小球硬化癥，隨著糖尿病患病率的日趨增加，糖尿病腎病患病率亦隨之增加。近年來，中醫(yī)藥在防治糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展及延緩腎功能惡化等方面顯示出顯著的優(yōu)勢［1］，各代醫(yī)家分別從脾虛論、腎虛論、脾腎兩虛論、水濕痰濁毒邪論、瘀血論、絡(luò)病學［2］等方面對其可能中醫(yī)病機進行了闡述。

4.1空腹血糖與糖尿病腎病 高血糖是糖尿病最常見的癥狀之一，而且血糖值的高低也可以作為反映糖尿病的一個參考指標［3］?？崭寡欠从骋葝uβ細胞的生理功能，也是糖尿病最常用的檢測指標之一，反映基礎(chǔ)胰島素的分泌功能。神經(jīng)系統(tǒng)和激素可調(diào)節(jié)血糖濃度使其保持相對穩(wěn)定［4］。當調(diào)節(jié)失去平衡后，則會出現(xiàn)低血糖或高血糖。

圖1　RT-PCR檢測大鼠腎組織AT1R的相對定量值（RQ值）Fig.1 Rat kidney tissue relative quantitative value of AT1R w ith Real time-PCR（RQ）

圖2　Real time-PCR檢測大鼠腎組織AGTRAP的相對定量值（RQ值）Fig.2 Rat kidney tissue relative quantitative value of AGTRAP w ith Real time-PCR（RQ）

圖3　Real time-PCR檢測大鼠腎組織CTGF的相對定量值（RQ值）Fig.3 Rat kidney tissue relative quantitative value of CTGF w ith Real time-PCR（RQ）

研究表明，蓯歸益腎膠囊不同劑量給藥組大鼠血糖濃度低于模型組大鼠血糖值，與陽性藥組無顯著性差異，且隨劑量而有所變化，結(jié)果顯示蓯歸益腎膠囊具有降低糖尿病腎病模型大鼠血糖之作用，進而對糖尿病腎病模型大鼠呈現(xiàn)一定治療作用。

4.2尿微蛋白與糖尿病腎病 糖尿病腎病另一主要表現(xiàn)形式為產(chǎn)生蛋白尿。在糖尿病腎病初期表現(xiàn)為微量白蛋白尿，此為早期糖尿病腎病主要特點，可預測糖尿病腎病發(fā)生的發(fā)展，且與預后亦有關(guān)聯(lián)。隨病情進展，尿蛋白排量逐漸增加，尿蛋白量值為臨床診斷糖尿病腎病重要指標，同時反映并預示糖尿病患者病情發(fā)展階段［5］。

本研究結(jié)果顯示，蓯歸益腎膠囊給藥組24 h尿蛋白量低于糖尿病腎病模型組大鼠24 h尿蛋白量，且與陽性藥組無顯著性差異，說明蓯歸益腎膠囊對糖尿病腎病模型大鼠具有一定的治療效果。

4.3AngⅡ與糖尿病腎病 AngⅡ是AngⅠ在轉(zhuǎn)化酶作用下的水解產(chǎn)物，AngⅡ是血管緊張素的重要組成部分［6-7］。人體的腎上腺皮質(zhì)球狀帶細胞、血管平滑肌、腦、腎和心臟上的細胞存在有血管緊張素受體。血管緊張素受體與AngⅡ結(jié)合，產(chǎn)生部分生理效應(yīng)；AngⅡ作用于血管平滑肌，可使全身微動脈收縮，動脈血壓升高，是目前已知最強的縮血管活性物質(zhì)之一。研究表明，糖尿病患者在出現(xiàn)腎病之前，血壓呈現(xiàn)上升態(tài)勢，而高血壓亦能加速腎病之發(fā)展，合并高血壓患者常在短時間內(nèi)即可呈現(xiàn)腎衰竭癥狀。故有效的降壓治療可顯著延緩糖尿病腎病的發(fā)展［8］。

本實驗結(jié)果顯示模型組大鼠AngⅡ水平高于空白組大鼠，蓯歸益腎高劑量組大鼠AngⅡ水平明顯低于模型組，蓯歸益腎中劑量組和低劑量組大鼠AngⅡ水平與模型組大鼠無顯著性差異，表明蓯歸益腎膠囊具有降低糖尿病腎病模型大鼠AngⅡ水平的作用，進而降血壓，延緩糖尿病腎病的發(fā)展，延長患者生命。其療效與用藥劑量有關(guān)，這可能是蓯歸益腎膠囊治療糖尿病腎病的作用機制之一。

4.4AT1R與糖尿病腎病 AngⅡ的主要受體為AT1R［9-10］，于腎臟內(nèi)廣泛存在，AT1R介導AngⅡ?qū)M織的效應(yīng)，其表達變化調(diào)節(jié)AngⅡ生物學效應(yīng)，反應(yīng)出腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的生物學活性水平［11］。

本實驗研究結(jié)果表明，蓯歸益腎膠囊不同劑量給藥組大鼠AT1R和AngⅡ較模型組顯著降低，顯示蓯歸益腎膠囊可能具有作用于AngⅡ受體，進而降低血壓的作用。其機制可能為蓯歸益腎膠囊抑制AngⅡ和AT1R結(jié)合，使主動脈局部AngⅡ作用減弱，降低血管AT1R的表達上調(diào)。

4.5AGTRAP與糖尿病腎病 AGTRAP是存在于AngⅡ的作用靶點上的一類特殊蛋白質(zhì)［12-13］，對AngⅡ具有特異性識別功能并與之結(jié)合產(chǎn)生升血壓的作用［14］。本研究表明，蓯歸益腎膠囊高、中劑量組大鼠AGTRAP表達與模型組相比顯著降低，顯示蓯歸益腎膠囊可抑制AGTRAP的表達、部分阻斷AngⅡ與其結(jié)合、實現(xiàn)降低血壓、進而實現(xiàn)治療糖尿病腎病之目的。

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Preventive effects of Conggui Yishen Capsules on the diabetic nephropathy rats

DUAN Xian-chun， WANG Yong-zhong， FANG Zhao-hui*， WU Jian， GAO Jia-rong， LUO Huan，XIA Lun-zhu
（The First Affiliated Hospital of AnhuiUniυersity of ChineseMedicine，Grade Three Laboratory of Traditional ChineseMedicine Preparation，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Hefei230031，China）

AIM To study the protective effects of Conggui Yishen Capsules（Cistanches Herba，Angelicae sinensis Radix，Corni Fructus，Cinnamomi Ramulus，Alismatis Rhizoma，Moutan Cortex）on kidney of rat with diabetic nephropathy（DN）.METHODS One hundred and twenty SD rats were randomly divided into six groups，including normal control group，themodel group，Irbesartan groups，Conggui Yishen Capsules high-，medium-，and low-dosage groups.The DN modelwas prepared by intraperitoneal injection of STZ.The 24 h urinary protein，F(xiàn)BG，and the expression of AngⅡ，AT1R，AGTRAP，and CTGF weremeasured four weeks later.RESULTS After treatment，24 h urine protein，F(xiàn)BG，and AngⅡin three Conggui Yishen Capsules groupswere significantly lower than those of themodel group（P＜0.05）.CONCLUSION Conggui Yishen Capsules have therapeutic effects on DN rats.Themechanism may be related to down-regulation of AT1R，AGTRAP，CTGF and reduced amount of AngⅡ.

Conggui Yishen Capsules；diabetic nephropathy（DN）；angiotensinⅡ（AngⅡ）；angiotensinⅡtype 1 receptor（AT1R）；angiotensinⅡrecepter protein（AGTRAP）；connective tissue growth factor（CTGF）；rat

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0473-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.002

2014-01-15

國家中醫(yī)臨床研究基地重點病種糖尿病專項基金項目（JDZX2012001）；安徽省中醫(yī)發(fā)展省級專項補助資金項目（衛(wèi)中醫(yī)藥秘【2014】342號，2014ZYZJ02）；國家中醫(yī)藥管理局重點學科內(nèi)分泌學學科開發(fā)基金項目（2011nfmxk011、2011nfmxk012）；安徽高校省級自然科學研究（重點）項目（KJ2013A169）；安徽中醫(yī)學院臨床科學研究基金項目（2010LC-003A）；國家中醫(yī)藥重點學科臨床中藥學建設(shè)項目（國中醫(yī)人教發(fā)【2012】32號）

段賢春（1981—），男，碩士，主管藥師，從事中藥新藥研發(fā)與中藥神經(jīng)藥理學研究。Tel：（0551）62838702，E-mail：dxcflying2008@163.com

方朝暉，教授，主任醫(yī)師，從事中醫(yī)藥防治代謝內(nèi)分泌疾病的臨床研究。Tel：（0551）62850092，E-mail：fangzhaohui9097@163.com