一株海洋拮抗菌的篩選與鑒定

鄭　虹，李永秋，陳淑瓊，張文森，徐慧詮，唐慧華，鄧加聰*（.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；.福建師范大學(xué)福清分校朗姆多果酒研究所，福建福清350300）

一株海洋拮抗菌的篩選與鑒定

鄭虹1，李永秋1，陳淑瓊1，張文森2，徐慧詮2，唐慧華2，鄧加聰2*
（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；2.福建師范大學(xué)福清分校朗姆多果酒研究所，福建福清350300）

通過(guò)平板分離、搖瓶發(fā)酵，從樣品中分離到1株對(duì)枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、大腸桿菌等指示菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株HY4，通過(guò)菌落形態(tài)、鏡檢、生理生化試驗(yàn)和對(duì)菌株16S rRNA基因序列遺傳分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株跟芽孢桿菌屬（Bacillus）的多數(shù)菌株序列有99%的相似性，將該菌株命名為芽孢桿菌HY4。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，菌株的生物量達(dá)到最大值，OD600nm為2.49，此時(shí)菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌活性也達(dá)到最高，透明圈直徑分別為1.38 cm和1.13 cm，當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌活性也達(dá)到最大，透明圈直徑為1.13 cm，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性反而逐漸降低。

海洋拮抗菌；篩選；鑒定；抑菌活性

海洋面積占地球面積的70%以上，而長(zhǎng)期生活于海洋這一高壓、高鹽、嚴(yán)寒的封閉環(huán)境的海洋微生物，自身帶有一套特殊的代謝途徑，進(jìn)而產(chǎn)生一些作用獨(dú)特的代謝產(chǎn)物［1-3］。已發(fā)現(xiàn)的海洋微生物有沙雷氏菌屬［4］、芽孢桿菌屬［5-6］、不動(dòng)桿菌屬［7］、假單胞菌屬［8-10］、酵母菌屬［11］、鏈霉菌屬［12］、微藻［13］等，占整個(gè)海洋微生物不足5%。如此巨大的海洋資源尚未得到開(kāi)發(fā)利用，從海洋微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找新穎的生物活性物質(zhì)，成為當(dāng)前微生物學(xué)研究的一個(gè)重要方向。

本研究報(bào)道了1株對(duì)多種細(xì)菌具有拮抗作用的海洋菌株HY4的篩選、鑒定及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)該菌株生長(zhǎng)和抑菌活性的積累進(jìn)行了初步研究，以期為菌株HY4后期的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1分離材料與試驗(yàn)菌株

土樣和水樣：取自福清市江陰鎮(zhèn)近海海域；藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）：保存于福建師范大學(xué)福清分校生物與化學(xué)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2化學(xué)試劑

牛肉膏、氯化鈣、硫酸鎂、酵母膏、甘淮、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蔗糖、氯化鐵、磷酸二氫鈉、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、硫酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、尿素（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

分離平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，硝酸鉀1.0 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

試管斜面培養(yǎng)基（或牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂10.0 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，硝酸鉀1.0 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限公司；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱：蘇州江東精密儀器有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1850R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1海洋拮抗菌的分離純化

稱取1 g土樣或1 mL水樣加入100 mL無(wú)菌水中，搖勻后，取1 mL稀釋液接種于100 mL的富集培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；將富集液按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，稀釋至10-6、10-7、10-8，每個(gè)梯度取0.2 mL涂布于分離平板，30℃倒置培養(yǎng)24 h。

1.3.2海洋拮抗菌的初篩

將分離得到的單菌落用點(diǎn)接的方法接種于接種有指示菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板和沒(méi)有指示菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板（作為對(duì)照）上，每株菌重復(fù)3個(gè)平行，1個(gè)對(duì)照，30℃倒置培養(yǎng)24 h，篩選出有抑菌圈的菌株接種于試管斜面，編號(hào)，4℃冰箱保存，備用。

1.3.3海洋拮抗菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于試管斜面30℃活化24 h；從活化好的試管斜面中挑取2環(huán)菌苔，接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.3.4海洋拮抗菌的鑒定

海洋拮抗的部分生理生化鑒定參照文獻(xiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌快速鑒定手冊(cè)》［14］、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［15］進(jìn)行。

1.3.5菌株HY416S rRNA基因序列遺傳分析

（1）菌株HY4基因組的提取

按照生工SK8255柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA。

（2）16S rRNA基因的擴(kuò)增與分析

采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物16s-F：5′-CA GAGTTTGATCCTGGCT-3′，反向引物16s-R：5′-AGGAG GTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL、dNTP 1 μL、PCR引物各0.5 μL、Taq酶0.5 μL、DNA模板0.5 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃、4 min；94℃、45 s，55℃、45 s，72℃、1 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

16S rRNA基因測(cè)序委托上海生工公司完成。測(cè)序序列與NCBI網(wǎng)站GenBank中的已知序列進(jìn)行Blast。采用MAGE 4.0軟件中Bootstrap Test of Phylogeny的N-J算法（bootstrap參數(shù)為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的分析。

1.3.6培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株HY4產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響

冰箱保存的菌株HY4接種于試管斜面30℃活化24 h；從活化好的試管斜面中挑取2環(huán)菌苔，接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.7發(fā)酵液中抑菌活性的測(cè)定

細(xì)菌抑菌活性的測(cè)定方法采用牛津杯法［16-17］。

取50 mL發(fā)酵液5 000 r/min、4℃離心5 min，收集上清液備用；活化后的指示菌用無(wú)菌水刮下菌苔并稀釋，使菌懸液濃度為107CFU/mL，備用；在平板中加入10 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，凝固后再加入混有指示菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（每100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入1 mL上述指示菌菌懸液），每個(gè)平板加入6個(gè)牛津杯；在平板的每個(gè)牛津杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，于37℃靜置培養(yǎng)16 h，觀察并記錄結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1海洋拮抗菌的初篩

將分離純化篩選到的單菌落點(diǎn)接于接種有指示菌的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)24 h。經(jīng)過(guò)稀釋分離和平板初篩，從土樣和水樣中共分離得到7株對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和藤黃八疊球菌都有抗性的菌株，編號(hào)為HY1、HY2、HY3、HY4、HY5、HY6、HY7。

2.2海洋拮抗菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72 h，采用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　不同菌株對(duì)指示菌的抑菌性Fig.1 Antimicrobial activity of different strains on the indicator bacteria

由圖1可見(jiàn)，初篩得到的7株具有抑菌活性的拮抗菌，其抑菌性有一定的差別，菌株HY3、HY4、HY5及HY7對(duì)3種指示菌的透明圈直徑均＞1 cm，其中菌株HY4對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和藤黃八疊桿菌抑菌圈直徑分別為1.25cm、1.30 cm和1.23 cm。因此選擇菌株HY4作為本試驗(yàn)的研究對(duì)象。

2.3海洋拮抗菌HY4的初步鑒定

2.3.1海洋拮抗菌HY4的菌落和菌株形態(tài)觀察

將菌株HY4接種于試管斜面30℃活化24 h，進(jìn)行菌落和菌株形態(tài)觀察。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　菌株HY4菌落（A）和菌株形態(tài)（B）Fig.2 Colonies（A）and strain morphology（B）of the strain HY4

由圖2可見(jiàn)，在分離平板培養(yǎng)基上，菌株HY4的菌落顏色為乳白色，菌落較大，濕潤(rùn)；顯微鏡下，菌株呈桿狀結(jié)構(gòu)，革蘭氏染色為陽(yáng)性。

2.3.2海洋拮抗菌HY4的生理生化鑒定

按文獻(xiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌快速鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株HY4的部分生理生化進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　菌株HY4的部分生理生化試驗(yàn)Table1 Physiological and biochemical tests of the strain HY4

由表1可知，菌株HY4可水解淀粉，明膠液化，會(huì)產(chǎn)生脲酶。

2.4海洋拮抗菌HY4 16S rRNA的遺傳分析

2.4.1海洋拮抗菌HY4基因組的提取及擴(kuò)增

將提取到的菌株HY4基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)電泳得知該擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 424 bp的16S rRNA基因。

圖3　菌株HY4 16S rRNA電泳圖Fig.3 The electrophoregram of 16S rRNA of the strain HY4

2.4.2菌株16S rRNA基因遺傳學(xué)分析

將提取得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序后，與NCBI網(wǎng)站的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株的序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）的多株菌具有99%以上的同源性。隨機(jī)抽取若干個(gè)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，菌株HY4與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為一類(lèi)，且與登陸號(hào)EU584537.1、KJ943972.1等菌株16S rRNA序列的同源性達(dá)到99%。因此，在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)學(xué)上，將該菌株鑒定為芽孢桿菌，命名為芽孢桿菌（Bacillussp.）HY4。

圖4　菌株HY4的序列分析Tig.4 Sequence analysis of the strain HY4

2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)海洋拮抗菌HY4抗拒性的影響

活化后的菌株HY4接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)，以枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、大腸桿菌為指示菌，每隔12 h測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株HY4產(chǎn)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of culture time on the antibacterial activity of the strain HY4

由圖5可見(jiàn)，菌株HY4的生物量及對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌性均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增后降的趨勢(shì)，菌株HY4的生物量完全符合細(xì)菌生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期：0～12 h為菌株HY4的適應(yīng)期，12～36 h為該菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36～72 h為菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，72 h后是菌株的衰亡期，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，菌株的生物量達(dá)到最大值，OD600nm為2.49，此時(shí)菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌活性也達(dá)到最高，透明圈直徑分別為1.38 cm和1.13 cm，當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌活性也達(dá)到最大，透明圈直徑為1.13 cm，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性反而逐漸降低。由此可見(jiàn)，菌株抑菌活性的產(chǎn)生和積累與菌株的生長(zhǎng)不呈平行關(guān)系。

3　結(jié)論

通過(guò)平板分離、搖瓶發(fā)酵，從江陰碼頭附近海域中分離到1株對(duì)枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、大腸桿菌等指示菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株HY4；通過(guò)菌落形態(tài)、鏡檢、生理生化試驗(yàn)和菌株16S rRNA基因序列遺傳分析，發(fā)現(xiàn)該菌株跟芽孢桿菌屬（Bacillus）的多數(shù)菌株的16S rRNA基因序列有99%的相似性，將該菌株鑒定為芽孢桿菌HY4（BacillusHY4）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，菌株的生物量達(dá)到最大值，OD600nm為2.49，此時(shí)菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌活性也達(dá)到最高，透明圈直徑分別為1.38 cm和1.13 cm，當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌活性也達(dá)到最大，透明圈直徑為1.13 cm，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性反而逐漸降低。

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Screening and identification of a marine antagonistic bacterium

ZHENG Hong1，LI Yongqiu1，CHEN Shuqiong1，ZHANG Wensen2，XU Huiquan2，TANG Huihua2，Deng Jiacong2*
（1.College of Ocean and Biochemical Engineering，F(xiàn)uqing Branch of Fujian Normal University，F(xiàn)uqing 350300，China；2.Institute of Rum Wine，F(xiàn)uqing Branch of Fujian Normal University，F(xiàn)uqing 350300，China）

The strain HY4 which had antibacterial activity onBacillus subtilis，Sarcina lutea，Escherichia coliwas isolated from the samples through the plate separation，shake flask fermentation.The strain HY4 had 99%similarity to the most ofBacillussequence and was identified asBacillus HY4 by colony morphology，microscopy，physiological and biochemical tests and 16S rRNA gene sequence.When culture time was 48 h，the biomass of strain reached the maximum and OD600nmwas 2.49.At the moment，the antibacterial activity of the strain onB.subtilisandS.luteaalso reached the maximum，and the diameter of transparent circle were 1.38 cm and 1.13 cm，respectively.When culture time was 60 h，the antibacterial activity of the strain onE.colireached the maximum，and the diameter of transparent circle was 1.13 cm.Then with the prolongation of culture time，the antibacterial activity reduced gradually.

marine antagonistic bacterium；screening；identification；antibacterial activity

Q93

A

0254-5071（2015）11-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.025

2015-10-12

福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目（20422335）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01132）；福建省教育廳中青年教師項(xiàng)目（JA15569）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA11285）；福建省科技計(jì)劃引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015N0004）

鄭虹（1981-），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锞旰Y選及發(fā)酵。

鄧加聰（1981-），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锞旰Y選及發(fā)酵。