維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型生物性狀的影響

宋強(qiáng)，雍海溟

（1.寧夏人民醫(yī)院骨二科寧夏銀川750001；2.寧夏人民醫(yī)院眼科醫(yī)院寧夏銀川750001）

維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型生物性狀的影響

宋強(qiáng)1，雍海溟2

（1.寧夏人民醫(yī)院骨二科寧夏銀川750001；2.寧夏人民醫(yī)院眼科醫(yī)院寧夏銀川750001）

目的：觀察維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型生物性狀的影響。方法：建立兔耳增生性瘢痕模型，用不同濃度的維甲酸作用于動(dòng)物模型，檢測(cè)MTT值，觀察其形態(tài)學(xué)，組織學(xué)及Ⅰ型膠原含量的改變，利用半定量RTPCR分析用藥前后cyclinD1的mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：維甲酸能抑制瘢痕中成纖維細(xì)胞的增殖，使動(dòng)物模型瘢痕體積縮小，組織結(jié)構(gòu)向普通瘢痕轉(zhuǎn)化，降低瘢痕中Ⅰ型膠原含量及cyclinD1的mRNA表達(dá)。結(jié)論：維甲酸可以抑制成纖維細(xì)胞增殖及降解增生性瘢痕的Ⅰ型膠原含量，對(duì)增生性瘢痕有一定的治療作用。

維甲酸；增生性瘢痕；Ⅰ型膠原；cyclinD1

增生性瘢痕其病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但目前公認(rèn)增生性瘢痕其發(fā)生機(jī)制主要與成纖維細(xì)胞的大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的異常代謝有關(guān)［1-4］。研究表明，維甲酸可干擾成纖維細(xì)胞的DNA合成，抑制其增殖，降解Ⅰ型膠原含量，但其作用機(jī)制尚有爭(zhēng)議［5-9］。

本實(shí)驗(yàn)是建立在增生性瘢痕動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，探討維甲酸局部應(yīng)用對(duì)瘢痕組織成纖維細(xì)胞與Ⅰ型膠原代謝的影響，為臨床治療增生性瘢痕提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本長(zhǎng)耳白兔12只，雌雄不限，體重1.5～2.5kg，月齡3個(gè)月左右，購(gòu)自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飼料，自由飲食。

1.1.2主要試劑：維甲酸（Retinoic Acid，RA）MTT，DMSO（Sigma公司，美國(guó)）Trizol總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國(guó)），新生小牛血清（天津TBD公司），CyclinD1引物（大連英俊生物技術(shù)有限公司），Van Gieson液。

1.1.3主要儀器：光學(xué)顯微鏡，CO2孵箱，自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀，OLYMPVSBX60照相系列。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1瘢痕動(dòng)物模型的制備：取約3個(gè)月大小的日本長(zhǎng)耳白兔12只行氯胺酮（15mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后將兔俯臥位固定于操作臺(tái)上，常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，每側(cè)兔耳腹側(cè)面均手術(shù)切除直徑為10～15mm的全層皮膚，刮除軟骨膜，每耳2處，各創(chuàng)面間隔15mm以上，共48個(gè)創(chuàng)面，創(chuàng)面暴露，待創(chuàng)面上皮化后20d，瘢痕增生塊形成。其中4只做細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)，剩余的8只做給藥組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)［10-12］。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)材料取自動(dòng)物模型上切下的增生性瘢痕組織。取下的組織在無菌間用含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次，然后用無菌眼科剪刀將組織剪成0.5～1mm3大小的小塊，接種于含20%小牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）的CO2孵箱中培養(yǎng)，1周換3次培養(yǎng)液，待3周后細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出并融合成致密的單層后用0.25%胰蛋白酶消化，按1:4傳代，藥物實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為3～8代，其余細(xì)胞用凍存液保存以備后用［13］。

1.2.3MTT比色法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞（FB）制成5×104懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，置于37℃，5%的CO2飽和溫度下孵育24h，待細(xì)胞完全鐵壁后去上清液，分別加入濃度為1×10-6mol/l、1×10-5mol/l、1×10-4mol/l、1×10-3mol/l的維甲酸和10%小牛血清的DMEM 200μl，培養(yǎng)后每組設(shè)4個(gè)平行孔及空白對(duì)照孔。加藥后繼續(xù)孵育48h，然后每孔加MTT（5mg/ml）20μl繼續(xù)孵育3h，去上清，每孔加200μlDMSO振蕩混勻，用自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀在設(shè)定波長(zhǎng)492nm時(shí)測(cè)定其OD值。計(jì)算藥物的抑制率（IR）。IR=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%

1.2.4總RNA提?。簩⑵餍担ㄒ埔汗艿龋┙萦?.1% DEPC溶液中12h后，70℃～80℃烘烤干燥；103.4kPa，121℃高壓滅菌15min；再次70℃～80℃烘烤干燥即可使用。將濃度為1×10-5mol/l的維甲酸加入含有1×106個(gè)/ml第3～8代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，孵育48h，收獲細(xì)胞。棄培養(yǎng)液，加入1ml Trizol，室溫孵育5min，然后裝到2.0ml的離心管中。加入300ml氯仿，振搖15s，室溫孵育10min。12，000×g、4℃、離心15min，小心吸取上清移至另一離心管中，棄沉淀。加入等體積的異丙醇，混勻后4℃、12，000×g、20min離心。棄上清，加75%乙醇溶液洗滌沉淀，將沉淀于室溫晾干。加入20μl DEPC處理水溶解RNA取2.0μl溶液于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)質(zhì)量，可見2條28S、18S清晰熒光亮帶，說明所提取的RNA完整。用TU-1800紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值均＞1.9，確定RNA純度與濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。剩余總RNA標(biāo)本-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5MT-RT-PCR：CyclinD1基因表達(dá)的變化采用半定量RT-PCR方法。首先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500），按說明書合成cDNA。MT-RT-PCR反應(yīng)體系為25μl，構(gòu)成如下：10倍的buffer 2.5μl，dNTP 2μl，模板4μg，特異性引物上下游各1μl，β-actin上下游引物個(gè)1μl，Taq酶2.5U，加水至總反應(yīng)體積25μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，72℃延伸1min，并循環(huán)30次，最后72℃再延伸8min終止反應(yīng)。

1.2.6引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用primer5.0輔助設(shè)計(jì)引物［14-15］：cyclinD1，序列5'GAGACCATCCCCCTGACGGC-3'和5' TCTTCCTCCTCCTCGGCGGC-3'，長(zhǎng)度484bp，退火溫度60℃。

1.2.7PCR產(chǎn)物分析：取6μlPCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠掃描成像分析儀處理系統(tǒng)進(jìn)行強(qiáng)度與面積掃描，用特異性基因條帶（強(qiáng)度×面積）的比值作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA的相對(duì)含量，比較增生性瘢痕與正常兔耳皮膚及藥物作用后增生性瘢痕中的cyclin D1的mRNA表達(dá)的變化。

1.2.8給藥方式：局部瘢痕內(nèi)注射給藥，在8只兔子中隨機(jī)將每只兔子的一只耳歸入實(shí)驗(yàn)組，另一只耳歸入對(duì)照組，每組各8只，實(shí)驗(yàn)組每周，每個(gè)瘢痕內(nèi)注射濃度為1×10-5mol/l的維甲酸0.2ml，對(duì)照組同法注射生理鹽水。共4周。

1.2.9檢測(cè)指標(biāo)

1.2.9.1大體形態(tài)及副反應(yīng)觀察：治療后不同時(shí)間，觀察瘢痕動(dòng)物模型的體積變化，硬度，局部反應(yīng)等。

1.2.9.2組織學(xué)觀察：標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，做HE染色，供光鏡下觀察，切片每組選擇6張，每張隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)算瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞核數(shù)量，對(duì)其行體視學(xué)形態(tài)定量分析。

1.2.9.3 Van Gieson（V.G）染色檢測(cè)Ⅰ型膠原含量用V.G染色方法，石蠟組織切片厚5μm，常規(guī)脫臘至水，蒸餾水清洗。切片上滴染Van Gieson液，蒸餾水洗2次。無水乙醇脫水，二甲苯透明和中性樹膠封固，光鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所測(cè)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較用單因素方差分析，以SPSS for Windows10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。

表1　維甲酸對(duì)兔耳瘢痕培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的作用（MTT法）

表2　用藥前后各組瘢痕體積和成纖維細(xì)胞核數(shù)量

2　結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況

應(yīng)用不同濃度的RA培養(yǎng)液作用培養(yǎng)成纖維細(xì)胞72h后，細(xì)胞增殖速度減慢，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有明顯的顯著性差異。而且在1×10-3～1×10-6mol/L情況下隨藥物濃度增加，細(xì)胞受到抑制程度也越大，亞甲基藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)越少，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。IR=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%（見表1）。

圖1　用藥前瘢痕組織光鏡下

圖2　維甲酸1×10-5mol/L治療4周后光鏡下

圖3　治療前的瘢痕組織Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)

圖4　維甲酸1×10-5mol/L治療4周后，瘢痕組織Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)

2.2各組瘢痕治療后體積變化

治療4周后，與陰性對(duì)照組相比，A組體積變化有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

2.3光鏡檢查用藥前后成纖維細(xì)胞的變化

治療前，瘢痕組織結(jié)構(gòu)致密，膠原豐富、排列紊亂，成纖維細(xì)胞多，核分裂相較多（如圖1），用藥后，成纖維細(xì)胞稀少，膠原稀疏，排列規(guī)則（如圖2）。成纖維細(xì)胞體視學(xué)定量結(jié)果表明，用藥組與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)下降有顯著性差異（P＜0.05）。

圖5　cyclinD1和β-actinPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表3　cyclinD1的mRNA在增生性瘢痕和正常兔耳皮膚中的表達(dá)

表4　維甲酸對(duì)增生性瘢痕FB中cyclinD1轉(zhuǎn)錄的影響

2.4Ⅰ型膠原含量測(cè)定

Ⅰ型膠原主要分布于真皮的細(xì)胞間質(zhì)，成纖維細(xì)胞、血管壁上亦見少量的陽性信號(hào)。用藥4周后，與陰性對(duì)照組相比治療組Ⅰ型膠原含量下降明顯（P＜0.05），見表2，如圖3～4。

2.5正常兔耳皮膚成纖維細(xì)胞與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞cyclinD1的mRNA表達(dá)水平的變化

增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中cyclinD1的表達(dá)與正常兔耳皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)相比呈顯著升高趨勢(shì)（增生性瘢痕：0.899±0.085；正常兔耳皮膚：0.686±0.041），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6維甲酸對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中cyclinD1的mRNA表達(dá)的影響

對(duì)用維甲酸（濃度為1×10-5mol/l）培養(yǎng)48 h的成纖維細(xì)胞進(jìn)行MT-RT-PCR（見表4），cyclinD1的表達(dá)明顯下降（如圖5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

3.1維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型瘢痕體積的影響

筆者在不同時(shí)間對(duì)注射過藥物的瘢痕模型觀察測(cè)量，發(fā)現(xiàn)隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)，瘢痕體積逐漸縮小。用藥4周后，用藥組體積變化與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明維甲酸治療一段時(shí)間后，出現(xiàn)一定療效。

3.2維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

用藥4周后，用藥組成纖維細(xì)胞稀少，膠原稀疏，排列規(guī)則。成纖維細(xì)胞體視學(xué)定量結(jié)果（見表2）表明：用藥4周，用藥組與陰性對(duì)照組相比下降明顯（P＜0.01）。結(jié)果顯示，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，膠原纖維由原來的排列紊亂變?yōu)橼呌谄叫羞@些均說明治療后增生性瘢痕組織的組織學(xué)特點(diǎn)向普通瘢痕轉(zhuǎn)變。

3.3維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型I型膠原含量的影響

研究證實(shí)，增生性瘢痕的發(fā)生過程中，I型膠原纖維明顯增加，通過檢測(cè)用藥前后I型膠原的含量變化能反映瘢痕組織的轉(zhuǎn)化情況。本研究顯示，用藥4周后，用藥組Ⅰ型膠原含量下降明顯［16-17］。

3.4維甲酸對(duì)增生性瘢痕動(dòng)物模型cyclinD1表達(dá)的影響

用藥組與陰性對(duì)照組相比，用藥后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的cyclinD1的轉(zhuǎn)錄水平降低（P＜0.05）由此推測(cè)，cyclinD1表達(dá)異常是增生性瘢痕發(fā)生的重要因素，但cyclinD1在增生性瘢痕中表達(dá)異常的機(jī)理有待進(jìn)一步研究［18-20］。

本研究顯示，將維甲酸注射于增生性瘢痕動(dòng)物模型中，藥物濃度取1×10-5mol/L、治療4周、每周給藥1次后，瘢痕體積明顯縮小，組織結(jié)構(gòu)向普通瘢痕轉(zhuǎn)化，瘢痕中I型膠原含量明顯下降及cyclinD1的轉(zhuǎn)錄水平降低；說明維甲酸對(duì)瘢痕動(dòng)物模型具有良好的治療作用，對(duì)該藥應(yīng)用于臨床治療病理性瘢痕具有重要的指導(dǎo)意義。

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編輯/何志斌

Effects of retinoic acid on hypertrophic scar in rabbit ears

SONG Qiang，YONG Hai-ming
（1.Department of Orthopedics，Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital，Yinchuan 750001，Ningxia，China；2.Eye Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital，Yinchuan 750001，Ningxia，China）

Objective To investigate the effects of retinoic acid on hypertrophic scar in rabbit ears. Methods After treated with the models of hypertrophic scar in rabbit ears on different concentration of retinoic acid，the morphology，histology，and typeⅠcollagen content of the scar tissues wereexamined afer the administration.meanwhile，inhibition rate and mRNA expression of cyclinD1，were detected by MTT assayand semi-quantitative RT-PCR respectively.ResultsRetinoic acid can significantly inhibit the fibroblasts from keloid，reduce the volume of the impanted pathological scars in the animal models，and histologically，the scar tissue exhibited a transition to the normal scar architecture with decreased type I collagen content and the expression of cyclin D1 mRNA. Conclusion Retinoic acid can inhibite the proliferation of fibroblast and degrade the content of type I collagen of hypertrophic.these results suggested that retinoic acid may has therapeutical effect on hypertrophic scar.

retinoic acid；hypertrophic scar；type I collagen；CyclinD1

R62 R619+.6

A

1008-6455（2014）10-0038-05

2014-09-17

2015-03-29