大蒜中γ-谷氨酰半胱氨酸衍生物對(duì)食品加工中晚期糖基化終產(chǎn)物的抑制作用

劉玲，石飛*，閆鳳嬌，白冰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

大蒜中γ-谷氨酰半胱氨酸衍生物對(duì)食品加工中晚期糖基化終產(chǎn)物的抑制作用

劉玲，石飛*，閆鳳嬌，白冰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

目的：比較大蒜中提取的γ-谷氨酰半胱氨酸衍生物γ-谷氨酰-甲基-半胱氨酸（γ-glutamyl-methyl-cysteine，γ-GMC）、γ-谷氨酰-丙基-半胱氨酸（γ-glutamyl-propyl-cysteine，γ-GPC）及人工合成的γ-谷氨酰-丁基-半胱氨酸（γ-glutamyl-butyl-cysteine，γ-GBC）對(duì)食品加工中產(chǎn)生的晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）的抑制作用。方法：在加入抑制劑條件下，通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸光光度法檢測(cè)反應(yīng)初產(chǎn)物乙二醛、果糖胺生成量的變化；運(yùn)用熒光法檢測(cè)戊糖素和熒光性AGEs在反應(yīng)過(guò)程中生成量的變化；采用高效液相色譜法檢測(cè)終產(chǎn)物羧甲基賴氨酸（carboxymethyl lysine，CML）生成量的變化。結(jié)果：γ-GMC和γ-GPC對(duì)早中期反應(yīng)產(chǎn)物抑制效果較好，而γ-GBC對(duì)末期產(chǎn)物抑制效果明顯，3種抑制劑對(duì)于抑制熒光性產(chǎn)物效果相似。結(jié)論：3種半胱氨酸衍生物均可抑制晚期糖基化反應(yīng)，因其取代基不同而對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物抑制效果不同，但對(duì)熒光性交聯(lián)產(chǎn)物抑制能力類(lèi)似。

γ-谷氨酰-甲基-半胱氨酸；γ-谷氨酰-丙基-半胱氨酸；γ-谷氨酰-丁基-半胱氨酸；糖基化終產(chǎn)物；抑制作用

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是一種廣泛存在于食品工業(yè)中的非酶糖基化反應(yīng)過(guò)程，主要由羰基化合物（主要為還原糖）與氨基化合物（氨基酸、蛋白質(zhì)等）反應(yīng)產(chǎn)生，形成大量的棕黑色大分子物質(zhì)（稱(chēng)類(lèi)黑素）［1］，反應(yīng)過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生多種具有不同氣味的中間體分子，這些產(chǎn)物對(duì)食品色、香、味的形成起著極為重要的作用。美拉德反應(yīng)不僅發(fā)生在溫度較高的食品烹煮過(guò)程，也可發(fā)生在室溫貯藏條件下，它包括一系列復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程，產(chǎn)物也復(fù)雜多樣，其中反應(yīng)產(chǎn)物之一晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）是目前醫(yī)學(xué)上的研究熱點(diǎn)［2-3］。AGEs是一類(lèi)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生聚合交聯(lián)、改變蛋白質(zhì)功能特性的產(chǎn)物，它涉及到糖尿病和衰老等相關(guān)病理的生理變化，并引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、腎病、白內(nèi)障、阿爾茨海默氏病、帕金森以及肌萎縮側(cè)索硬化等多種疾?。?］。體內(nèi)的AGEs在高血糖及腎功能衰竭的機(jī)體中易形成，體外攝入的AGEs大部分來(lái)自高營(yíng)養(yǎng)膳食。AGEs積累于機(jī)體不同組織器官中，AGEs不僅可以直接影響細(xì)胞與組織的功能、參與疾病的產(chǎn)生，也可通過(guò)與特異受體結(jié)合發(fā)生反應(yīng)來(lái)改變蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能，導(dǎo)致機(jī)體的病理變化。人體攝入富含AGEs的高營(yíng)養(yǎng)食品后，大約有10%的AGEs以小分子顆粒的形式與短肽和氨基酸一同進(jìn)入血液循環(huán)，剩下的AGEs1/3通過(guò)腎臟排出體外，其余2/3留在體內(nèi)參與體內(nèi)AGEs，激活細(xì)胞及促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究者通過(guò)抑制AGEs的形成，加速AGEs的降解，阻隔AGEs的氧化過(guò)程，阻斷AGEs與體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物受體的結(jié)合以及抑制結(jié)合蛋白的作用，來(lái)降低組織和血液中的AGEs含量，減輕AGEs的致病作用［5］。在AGEs抑制劑中，氨基胍目前作為臨床的主要用藥，但是它存在一定的致毒性，因此天然產(chǎn)物抑制劑的開(kāi)發(fā)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)硫胺素等對(duì)AGEs中的羧甲基賴氨酸（carboxymethyl lysine，CML）、羧乙基賴氨酸有很好的抑制作用［6］。

大蒜（Allium sativum L.）屬百合科蔥屬，世界各國(guó)均有分布，被認(rèn)為是日常最佳保健食品之一，常食之具有祛濕抗毒、健脾強(qiáng)身的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大蒜的保健和藥理功能與其中所含的特殊功能成分有關(guān)。大蒜獨(dú)特的辛辣氣味及功能成分來(lái)源于一類(lèi)性質(zhì)穩(wěn)定的風(fēng)味前體物質(zhì)S-烴基-半胱氨酸亞砜（S-hydrocarbylcysteine sulfoxides，CSOs），它是由γ-谷氨酰半胱氨酸肽（γ-glutamine peptides cysteine，γ-GPC）經(jīng)氧化酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化、再經(jīng)過(guò)一系列的氧化還原反應(yīng)形成揮發(fā)性的含硫化合物［7］。目前研究表明，CSOs含有4種衍生物，其中S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（S-allyl-L-cysteine sulfoxide，ACSO，蒜氨酸）含量最高，約占總量的85%，國(guó)外研究表明陳年大蒜中的這種物質(zhì)對(duì)體內(nèi)的非酶糖基化反應(yīng)有很好的抑制作用［8］。該類(lèi)有機(jī)硫化物也是大蒜的主要功能成分。Malgorzata等［9］研究發(fā)現(xiàn)陳年大蒜中的S-烯丙基半胱氨酸對(duì)糖基化反應(yīng)中蛋白質(zhì)的裂解、交聯(lián)有很好的抑制作用，并對(duì)無(wú)交聯(lián)性的糖基化產(chǎn)物CML有抑制作用；也有研究認(rèn)為因S-烯丙基半胱氨酸與還原糖的羰基反應(yīng)而阻礙了糖基化反應(yīng)及產(chǎn)物的生成［10］。但此類(lèi)研究主要基于模擬體內(nèi)糖基化反應(yīng)，是從醫(yī)學(xué)角度來(lái)考察CSOs對(duì)機(jī)體的作用。目前對(duì)食品加工過(guò)程中高營(yíng)養(yǎng)食品糖基化反應(yīng)的抑制作用鮮有報(bào)道，使得高營(yíng)養(yǎng)食品在加工中存在累積AGEs的隱患。

本課題組經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鮮蒜提取物對(duì)非酶糖基化也有很好的抑制作用，特別是在食品加工和貯藏過(guò)程中，鮮蒜中的半胱氨酸衍生物能夠在食品加工的中溫和高溫條件下有效抑制糖基化反應(yīng)，但機(jī)理尚不十分明確。本研究以鮮蒜中提取的主要半胱氨酸衍生物：γ-谷氨酰-甲基-半胱氨酸（glutamyl-methyl-cysteine，γ-GMC）和γ-GPC作為抑制劑，比較鮮蒜中不同取代基結(jié)構(gòu)的含硫化合物對(duì)AGEs的抑制作用，闡明鮮蒜中抑制AGEs的含硫化合物的主要作用位點(diǎn)，為深入探究鮮蒜中半胱氨酸肽類(lèi)成分對(duì)食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物的抑制機(jī)理提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

L-賴氨酸、D-葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、鹽酸羥胺、硝基四氮唑藍(lán)、無(wú)水乙醇、冰乙酸（分析純）、甲醇、甲酸（色譜純）上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨水、鹽酸（分析純）沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠；Dowex50×4-400陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、Dowex2×8-200陰離子交換樹(shù)脂美國(guó)Sigma-Aldrich公司；γ-GMC和γ-GPC實(shí)驗(yàn)室分離；γ-谷氨酰-丁基-半胱氨酸（γ-glutamyl-butyl-cysteine，γ-GBC）實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2儀器與設(shè)備

722紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4600熒光分光光度儀日本日立公司；D-2000 Elite制備型液相色譜儀日本Hitachi公司；Prominence LC-20AB高效液相色譜儀美國(guó)惠普公司。

1.3方法

1.3.1γ-GMC和γ-GPC的分離提取及γ-GBC的合成

稱(chēng)取新鮮大蒜1 000 g，加入800 mL無(wú)水乙醇，保鮮膜封口，水浴沸騰并保持5 min，冷卻，倒入打漿機(jī)，高速勻漿5 min，打碎成泥，6 層紗布粗濾，再濾紙過(guò)濾，泥漿添加500 mL無(wú)水乙醇二次提取，濾液合并，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約500 mL，用2 mol/L鹽酸調(diào)至pH 2.0，經(jīng)濾紙及0.45 μm膜過(guò)濾后離子交換柱分離。采用文獻(xiàn)［11-12］的改進(jìn)方法，Dowex 50×4-400陽(yáng)離子樹(shù)脂先用1 mol/L NaCl再生，并用大量去離子水洗滌至無(wú)氯離子流出（AgNO3檢測(cè)），將上步提取液以15 mL/min流速上Dowex 50×4-400陽(yáng)離子交換柱（5.0 cm×60 cm），15 mL/min流速下先用1 500 mL去離子水淋洗陽(yáng)離子柱，洗脫液棄去，再用1 500 mL 1 mol/L氨水淋洗陽(yáng)離子柱，收集黃色洗脫液。將洗脫液合并，75 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至約300 mL，經(jīng)10%冰乙酸調(diào)整至pH 7.0后以15 mL/min流速上Dowex 2×8-200陰離子交換柱（5.0 cm×40 cm，此柱先用1 mol/L乙酸鈉再生，后去離子水洗凈）。在15 mL/min流速下先用1 000 mL去離子水淋洗陰離子柱，洗脫液棄去，再用1 000 mL 10%冰乙酸淋洗陰離子柱，收集淺黃色洗脫液，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后冷凍干燥成淡黃色粉末，得到γ-GPC、γ-GMC粗提物，經(jīng)D-2000 Elite制備型液相色譜儀（色譜條件：Global Chromatography C18（250 mm×20 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（水）=60∶40；進(jìn)樣質(zhì)量濃度0.2 g/mL；進(jìn)樣量1 mL，流速4 mL/min；柱溫25 ℃）分離純化得到γ-GPC、γ-GMC。

稱(chēng)取L-半胱氨酸鹽酸鹽7.9g置于200mL燒杯中，然后加100mL無(wú)水乙醇，攪拌均勻后逐滴加入20mol/L的NaOH溶液11.25mL，溶液逐漸變成乳白色，攪拌2min后加7mL溴代正丁烷，攪拌5min，出現(xiàn)黏稠的膠狀的物質(zhì)，放置40min，用乙酸調(diào)至pH5.0～5.5，封口置于4℃冷藏過(guò)夜，抽濾并收集白色沉淀，干燥，得S-丁基-L-半胱氨酸。取S-丁基-L-半胱氨酸1.4g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaHCO3溶液15mL及6.5mL蒸餾水?dāng)噭?，pH7.5左右加入上步得到的溶液，攪拌7h，去掉有機(jī)層，乙酸乙酯洗2次，重復(fù)除去有機(jī)層，冰水冷卻，用6mol/L HCl調(diào)至pH2.5～3.0，在真空干燥器中干燥得到固體γ-GBC。

1.3.2L-賴氨酸與葡萄糖反應(yīng)體系的制備

將0.2mol/L的L-賴氨酸與0.6mol/L的葡萄糖以1∶3的質(zhì)量比溶解在pH8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中作為反應(yīng)體系［13］，在溫度為60℃恒溫箱中反應(yīng)1～5h。

1.3.3半胱氨酸衍生物抑制劑質(zhì)量濃度的確定

半胱氨酸衍生物γ-GMC、γ-GPC及γ-GBC分別選取0.10、0.15、0.20mg/mL3個(gè)質(zhì)量濃度，加入配制好的糖基化反應(yīng)體系，不加抑制劑組作空白對(duì)照，60℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，取4h后的反應(yīng)樣液進(jìn)行280～500nm波長(zhǎng)范圍掃描，比較不同質(zhì)量濃度抑制劑的抑制效果，確定抑制劑最佳抑制質(zhì)量濃度。

1.3.4早期糖基化產(chǎn)物乙二醛的測(cè)定

分別取1、2、3、4h各組反應(yīng)樣液0.5mL于50mL容量瓶中，加入15g/L乙酸鈉溶液1.0mL，2g/L鹽酸羥胺溶液2.0mL，50℃水浴加熱20min，冷卻后用蒸餾水定容，不加抑制劑組為空白對(duì)照，PBS緩沖液空白調(diào)零，測(cè)定233nm波長(zhǎng)處吸光度（A233nm）。

1.3.5早期糖基化產(chǎn)物果糖胺的測(cè)定

硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazolium，NBT）還原法［14］。分別取1、2、3、4h各組反應(yīng)樣液40μL，加0.025mol/L NBT試液2mL，37℃水浴反應(yīng)5min，以10%醋酸溶液中止反應(yīng)，不加抑制劑組為空白對(duì)照，PBS緩沖液空白調(diào)零，測(cè)定530nm波長(zhǎng)處的吸光度（A530nm）。

1.3.6戊糖素的測(cè)定

戊糖素具有熒光性，分別取1、2、3、4h各組反應(yīng)樣液0.1mL于小試管中，用PBS緩沖液30倍稀釋?zhuān)诩ぐl(fā)波長(zhǎng)335nm，發(fā)射波長(zhǎng)382nm波長(zhǎng)處測(cè)定熒光強(qiáng)度［15］。

1.3.7熒光性AGEs的測(cè)定

熒光性AGEs生成物具有自發(fā)熒光的特性，在激發(fā)波長(zhǎng)370nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm處有最大的吸收峰［16］。分別取1、2、3、4h各組反應(yīng)樣液0.1mL于小試管中，用PBS緩沖液30倍稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.3.8糖基化產(chǎn)物CML的測(cè)定

CML是非酶糖基化反應(yīng)中的重要產(chǎn)物，是產(chǎn)物AGEs中含量最多的一種，無(wú)熒光性。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法來(lái)檢測(cè)比較糖基化反應(yīng)體系中CML的生成量［17-20］。分別取反應(yīng)4h的各組反應(yīng)樣液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，20μL進(jìn)樣。

高效液相色譜法條件：色譜柱：Waters AtlantisT3C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：V（0.1%甲酸）∶V（甲醇）=70∶30；流速0.5mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL；運(yùn)行時(shí)間：10min。

1.4數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)分析；采用Origin8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1抑制劑最適質(zhì)量濃度的確定

通過(guò)改變3種抑制劑質(zhì)量濃度，表明三者的抑制作用都隨質(zhì)量濃度增加而增大，不同質(zhì)量濃度的γ-GMC、γ-GPC、γ-GBC加入非酶糖基化反應(yīng)體系中60℃反應(yīng)4h，冷卻后280～500nm紫外掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)合提取分離量，選擇中間質(zhì)量濃度0.15mg/mL作為實(shí)驗(yàn)中抑制劑的最佳抑制質(zhì)量濃度。

圖1　3種不同質(zhì)量濃度抑制劑在280～500nm波長(zhǎng)范圍掃描的光譜圖Fig.1Scanning spectra of three inhibitors at different concentrations in the wavelength range of280-500nm

2.2抑制劑對(duì)乙二醛的抑制作用

乙二醛是糖基化反應(yīng)的初中級(jí)產(chǎn)物，其生成量可以通過(guò)其與乙酸羥胺生成的乙二醛二肟的A233nm值來(lái)表示，吸光度大小反映了乙二醛在反應(yīng)體系中生成量的多少，通過(guò)吸光度可比較3種抑制劑的作用能力。由圖2可知，γ-GMC和γ-GBC對(duì)乙二醛沒(méi)有抑制作用，甚至這兩種抑制劑參與到反應(yīng)中使羰基化合物釋放出更多的乙二醛，而γ-GPC對(duì)乙二醛的抑制效果明顯（P＜0.05）。乙二醛是初中級(jí)產(chǎn)物，所以這個(gè)結(jié)果說(shuō)明γ-GMC和γ-GBC對(duì)糖基化反應(yīng)的初中期產(chǎn)物抑制效果差，而γ-GPC對(duì)初中期產(chǎn)物抑制效果好。

圖2不同抑制劑作用下乙二醛生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.2Plots of glyoxal production as a function of reaction time in the presence of different inhibitors

2.3抑制劑對(duì)果糖胺的抑制作用

果糖胺作為糖基化的早期產(chǎn)物，極大地影響著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。通過(guò)還原法對(duì)果糖胺測(cè)定，其吸光度的大小表明了反應(yīng)過(guò)程中果糖胺生成量的高低，進(jìn)而反映了抑制劑對(duì)糖基化早期反應(yīng)抑制能力的差異。由圖3可知，在不同反應(yīng)體系中，果糖胺的生成隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步下降，后期迅速上升。這說(shuō)明前期生成的果糖胺因逐步參與美拉德中末期反應(yīng)而消耗，吸光度呈下降趨勢(shì)；隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，果糖胺生成速率增大，后期累積，吸光度增加；對(duì)于抑制體系而言，γ-GMC開(kāi)始抑制作用明顯（P＜0.05），后期幾乎沒(méi)有抑制作用；γ-GPC則在后期抑制效果好（P＜0.05）；γ-GBC始終保持一定的抑制率，沒(méi)有隨反應(yīng)時(shí)間明顯變化。這說(shuō)明γ-GMC從初始就參與了抑制果糖胺的反應(yīng)，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)γ-GMC消耗殆盡，后期難以抑制果糖胺的生成；相反，γ-GPC可能是緩慢釋放參與抑制反應(yīng)，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出更多的基團(tuán)參與抑制反應(yīng)，使后來(lái)的抑制率明顯增加。通過(guò)反應(yīng)速率的對(duì)比，甲基衍生物（γ-GMC）抑制作用出現(xiàn)得早，說(shuō)明甲基在反應(yīng)過(guò)程中因分子小、空間位阻低，對(duì)谷氨酰-半胱氨酸類(lèi)抑制劑的抑制能力有促進(jìn)作用，而丙基衍生物（γ-GPC）則相反。對(duì)于丁基衍生物（γ-GBC），其變化趨勢(shì)與空白一致，很可能因?yàn)樵撗苌餅楹铣晌镔|(zhì)，在加速反應(yīng)過(guò)程中，丁基側(cè)鏈基團(tuán)沒(méi)有參與反應(yīng)。

圖3不同抑制劑作用下果糖胺的生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.3Plots of fructosamine production as a function of reaction time in the presence of different inhibitors

2.4抑制劑對(duì)戊糖素的抑制作用

戊糖素是戊糖和賴氨酸、精氨酸交聯(lián)反應(yīng)生成的主要糖基化終產(chǎn)物之一，具有熒光性［20-21］。熒光強(qiáng)度大小反映了戊糖素生成量的多少，戊糖素生成量可評(píng)估糖基化過(guò)程中蛋白質(zhì)損傷，也是衡量抑制劑對(duì)AGEs抑制作用的參考。由圖4可知，3個(gè)抑制劑組分別與空白對(duì)照組比較，γ-GBC在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的抑制效果一致，抑制率基本上在19%左右，而γ-GMC與γ-GPC在反應(yīng)前期（3h內(nèi)）抑制效果相似，后期γ-GMC抑制效果略好（P＜0.01）。因此就抑制戊糖素而言，3種抑制劑都具有一定的抑制能力，且抑制能力相近。

圖4不同抑制劑作用下戊糖素生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.4Plots of pentosidine production as a function of reaction time in the presence of different inhibitors

其機(jī)制可能是：半胱氨酸衍生物抑制劑本身是氨基酸類(lèi)物質(zhì)，在糖基化反應(yīng)體系中加入此類(lèi)抑制劑后，它們可能先與戊糖結(jié)合從而參與糖基化反應(yīng)，或者與阿姆德瑞產(chǎn)物結(jié)合，優(yōu)先占據(jù)美拉德反應(yīng)的交聯(lián)位點(diǎn)，導(dǎo)致戊糖與賴氨酸或其初級(jí)產(chǎn)物的交聯(lián)無(wú)法有效進(jìn)行，進(jìn)而抑制了交聯(lián)產(chǎn)物戊糖素的產(chǎn)生。

2.5抑制劑對(duì)熒光性AGEs的抑制作用

圖5不同抑制劑作用下AGEs隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.5Effect of different inhibitors on AGEs as a function of reaction time

AGEs會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能損傷，由于多數(shù)AGEs產(chǎn)物具有自發(fā)熒光性，因而可通過(guò)測(cè)定其熒光強(qiáng)度來(lái)反映AGEs水平［21-22］。由圖5可知，相對(duì)于空白對(duì)照組，γ-GBC的抑制效果始終不變，γ-GPC的抑制效果始終優(yōu)于γ-GBC，γ-GMC雖然前期抑制效果較差，但是后期抑制效果明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。由此可知，3類(lèi)

γ-谷氨酰-半胱氨酸衍生物對(duì)熒光性AGEs均有一定的抑制作用。AGEs是糖基化終產(chǎn)物的總稱(chēng)，包括一些具有熒光性的產(chǎn)物和一些無(wú)熒光性的物質(zhì)，兩類(lèi)物質(zhì)的反應(yīng)途徑不同，結(jié)構(gòu)也存在很大差異。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的反應(yīng)早期產(chǎn)物果糖胺和早中期產(chǎn)物乙二醛是由阿姆德瑞產(chǎn)物與多種糖酵解產(chǎn)物縮合形成的，它們進(jìn)一步反應(yīng)生成無(wú)熒光的終產(chǎn)物，如CML或吡咯素等；而熒光性AGEs主要是氨基酸之間的交聯(lián)產(chǎn)物，如戊糖素。2.4、2.5節(jié)的結(jié)果證明了半胱氨酸衍生物對(duì)熒光性產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制能力：3種抑制劑對(duì)戊糖素和熒光性AGEs的抑制效果一致，說(shuō)明糖基化反應(yīng)產(chǎn)物中熒光類(lèi)物質(zhì)具有相似結(jié)構(gòu)，而抑制劑對(duì)這類(lèi)產(chǎn)物的抑制能力也類(lèi)似。

2.6抑制劑對(duì)產(chǎn)物CML的抑制作用

圖6CML含量的HPLC圖HPLCFig.6Effect of different inhibitors on CML production

由圖6可知，空白對(duì)照組CML質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.34%，加入γ-GPC的體系中CML生成量最少，為34.96%；加入γ-GBC的次之為37.78%；加入γ-GMC的體系中CML質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.08%。通過(guò)比較可看出，抑制劑γ-GPC對(duì)CML生成的抑制作用最好（P＜0.05），結(jié)合2.2節(jié)得到的結(jié)論γ-GPC對(duì)乙二醛抑制效果最好，推斷γ-GPC對(duì)CML的抑制作用主要源于其對(duì)中間產(chǎn)物乙二醛生成的抑制，由此也間接證明反應(yīng)過(guò)程中乙二醛是合成CML的主要前體物質(zhì)。

3　討論

溫度是影響美拉德反應(yīng)的一個(gè)主要因素，溫度越高，褐變速度越快。實(shí)驗(yàn)以60℃作為體系的反應(yīng)溫度，與多數(shù)模擬體系設(shè)定的溫度不同，因?yàn)槎鄶?shù)文獻(xiàn)研究該類(lèi)反應(yīng)是以醫(yī)學(xué)研究為目的，所以設(shè)定的體系溫度多是37℃［23-25］，本研究的出發(fā)點(diǎn)是抑制食品加工過(guò)程中的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物，以60℃作為體系溫度，沒(méi)有采用高溫的加熱模型，目的是在相對(duì)溫和的反應(yīng)條件下觀察各中間產(chǎn)物的生成，從而明確抑制劑作用的位點(diǎn)，但這個(gè)溫度對(duì)于鮮蒜提取物的抑制作用是否最適合、是否能夠代表高溫反應(yīng)條件下的抑制能力還有待進(jìn)一步研究。

雖然大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了大蒜中活性物質(zhì)的抗氧化性，但其對(duì)非酶糖基化產(chǎn)物的抑制能力和機(jī)理研究較少。有文獻(xiàn)表明陳年大蒜中提取的抗氧化物質(zhì)，其中最主要是有機(jī)硫化合物S-烯丙基-L-半胱氨酸和S-烯丙基巰基-L-半胱氨酸，它們通過(guò)與還原糖羰基結(jié)合、螯合金屬離子等抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs的形成［26-27］。比較而言，鮮蒜中半胱氨酸衍生物的抗氧化性鮮有研究，抗糖基化作用也未見(jiàn)報(bào)道，鮮蒜中的γ-GMC、γ-GPC在結(jié)構(gòu)上與陳蒜中S-烯丙基-L-半胱氨酸的側(cè)鏈不同，因而其對(duì)糖基化反應(yīng)的抑制效果可能也不一樣。本研究中的3種半胱氨酸衍生物對(duì)糖基化反應(yīng)均有抑制作用，但由于食品的糖基化反應(yīng)是復(fù)雜的化學(xué)過(guò)程，具體的抑制機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

4　結(jié)論

通過(guò)鮮蒜γ-谷氨酰-半胱氨酸衍生物對(duì)葡糖糖與L-賴氨酸反應(yīng)體系早中期產(chǎn)物乙二醛和果糖胺，熒光性產(chǎn)物戊糖素，主要熒光產(chǎn)物AGEs及非熒光性產(chǎn)物CML抑制能力的實(shí)驗(yàn)，證明3種半胱氨酸衍生物均可抑制糖基化反應(yīng)。

進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)γ-GMC和γ-GPC對(duì)無(wú)熒光性的糖基化早中期的產(chǎn)物抑制效果好，而γ-GBC的抑制能力有限。3種抑制劑因取代基不同，體現(xiàn)了不同的抑制效果，說(shuō)明取代基不同對(duì)其抑制能力有一定影響，側(cè)鏈短的衍生物（甲基衍生物）其空間位阻小、分子小、能夠快速與還原糖的羰基反應(yīng)，并易于與小分子底物反應(yīng)；反之，側(cè)鏈長(zhǎng)的衍生物需要首先在高溫條件下變性后才能參與反應(yīng)。對(duì)于熒光性AGEs，3種半胱氨酸衍生物具有類(lèi)似的抑制效果，說(shuō)明3種抑制劑能夠有效抑制糖基化反應(yīng)中交聯(lián)性物質(zhì)的產(chǎn)生。

［1］BARZEGAR A，MOVAHEDI M，SATTARAHMADY N，et al.Spectroscopic studies of the effects of glycation of human serum albumin on L-Trp binding［J］.Protein and Peptide Letters，2007，14（1）：13-18.

［2］CONTRERAS C L，NOVAKOFSKI K C.Dietary advanced glycation end products and aging［J］.Nutrients，2010，2（12）：1247-1265.

［3］CHAO P，HSU C，YIN M.Analysis of glycation in sauces and saucestreated foods［J］.Food Chemistry，2009，113（1）：262-266.

［4］GOLDIN A，BECKMAN J，SCHMIDT A M，et al.Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury［J］.Circulation，2006，114（6）：597-605.

［5］KOSCHINSKY T，HE C J，MITSUHASHI T，et al.Orally absorbed reactive glycation products（glycotoxins）：an environmental risk factor in diabetic nephropathy［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，1997，94（12）：6474-6479.

［6］周燕瓊，金城，張英.晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）形成途徑、檢測(cè)方法和抑制手段研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（6）：175-184.

［7］張百俊，楊和連，劉愛(ài)琴.大蒜功能研究現(xiàn)狀［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（4）：33-35.

［8］李娜.大蒜的功效成分及其應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007（11）：25-27.

［9］MALGORZATA L，INGA M，LIDIA W.Biological properties of garlic and garlic-derived organic sulfur compounds［J］.Environmental and Molecular Mutagenesis，2009，50（3）：247-265.

［10］MACAN H，UYKIMPANG R，ALCONCEL M，et a1.Aged garlic extract may be safe for patients on warfarin therapy［J］.Nutrition，2006，136（3）：793-795.

［11］KUBEC R，VEL??EK J，KV??ALOV?M，et al.29Si and13C NMR spectra of tert-butyldimethylsilyl derivatives of amino acids［J］.Magnetic Resonance in Chemistry，Analytical Chemistry，2005，33（6）：458-460.

［12］LAWSON L D，WOOD S G，HUGHE B G.γ-Glutamyl-S-alkylcysteines in garlic and other Allzum spp.［J］.Journal of Natural Products，1991a，54（1）：436-444.

［13］YE X J，TB N，RYOJI N.Inhibitory effect of fermentation byproducts on formation of advanced glycation end-products［J］.Food Chemistry，2010，121（4）：1039-1045.

［14］SHENS C，TSENG C，WUJS B.An analysis of the glucose/glycine Maillard reaction pathways：influence of pH and reactant initial concentrations［J］.Food Chemistry，2005，92（3）：437-448.

［15］LIMA M，ASSAR S H，AMES J M.Formation of N-（carboxy-methyl）lysine and loss of lysine in casein glucose-fatty acicl model systems［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（3）：1954-1958.

［16］YAMAGISHI S，MATSUI T，NAKAMURA K.Possible link of food-derived advanced glycation end products（AGEs）to the development［J］.Medical Hypotheses，2008，71（6）：876-878.

［17］GOLDBERG T，CAI W，PEPPA M，et al.N-（carboxy-methyl）lysine content of foods commonly consumed in a Western style diet［J］.Food Chemistry，2012，131（1）：170-174.

［18］AMES J M.Determination of N-（carboxy-methyl）lysine in foods and related systems［J］.Annals of the New York Academy of Science，2008，1126（4）：20-24.

［19］ASSAR S H，MOLONEY C，LIMA M，et al.Determination of N-（carboxy-methyl）lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Amino Acids，2009，36（2）：317-326.

［20］CHIHAO W，SHANGMING H，JERAN L，et al.Inhibition of advanced glycation endproduct formation by foodstuffs［J］.Food Function，2011，2（5）：215-280.

［21］吳光杰，田穎剛，謝明勇，等.烏骨雞活性肽對(duì)體外非酶糖基化的抑制作用［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，31（5）：456-460.

［22］YEAMY J，TORAN N.Inhibitory effect of fermentation byproducts on formation of advanced glycation end-products［J］.Food Chemistry，2010，121（4）：1039-1045.

［23］XANTHIS A，HATZITOLIOS A，KOLIAKOS G，et al.Advanced glycation end products and nutrition-possible relation with diabetic atherosclerosis and how to prevention［J］.Journal of Food Science，2007，72（8）：125-129.

［24］JAIME U，SANDRA W，SUSAN G.Advanced glycation end products in foods and a practical guide to their reduction in the diet［J］.Journal of American Dietetic Association，2010，110（6）：911-916.

［25］閻淼淼，許真，徐蟬，等.大蒜功能成分的研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)，2010，31（5）：312-318.

［26］URIOS P，STERNBERG M.Flavonoids inhibit the formation of the cross-link AGE pentosidine in collagen incubated with glucose，according to their structure［J］.European Journal of Nutrition，2007，46（3）：139-146.

［27］MEGHA P，YADAGIRI R P，MUTHENNA G，et al.Prevention of non-enzymic glycation of proteins by dietary agents：prospects for alleviating diabetic complications［J］.British Journal of Nutrition，2009，101（11）：1714-1721.

Effect ofγ-Glutamyl Cysteine Derivatives from Garlic on Advanced Glycation End-Product（AGE）Formation during Food Processing

LIU Ling，SHI Fei*，YAN Fengjiao，BAI Bing
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China）

Three types of cysteine derivatives，γ-glutamyl-methyl-cysteine（γ-GMC），γ-glutamyl-propyl-cysteine（γ-GPC）andγ-glutamyl-butyl-cysteine（γ-GBC），were used for the inhibition of advanced glycation end-product（AGE）formation.

γ-GMC andγ-GPC were extracted from fresh garlic andγ-GBC was synthetic.In this study，after modeling，fructosamine and glycosylation，non-enzymatic glycosylation products were detected by ultraviolet-visible absorption spectrometry.Pentosidine and AGEs were analyzed by fluorescence spectrometry and carboxymethyl lysine（CML）was measured by HPLC.The results showed that the inhibition ability ofγ-GMC andγ-GPC were better for the non-fluorescent early and middle glycosylation reaction products.γ-GBC had an evident inhibitory effect on the late reaction products.In a word，three cysteine derivatives can effectively inhibit advanced glycation reaction but their effects are different because they have different substitution groups，and they have similar effects on the fluorescent cross-linked products.

γ-glutamyl-methyl-cysteine（γ-GMC）；γ-glutamyl-propyl-cysteine（γ-GPC）；γ-glutamyl-butyl-cysteine（γ-GBC）；advanced glycation end-products（AGEs）；inhibitory effect

TS201.2

A

1002-6630（2015）05-0050-06

10.7506/spkx1002-6630-201505010

2014-05-17

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014027003）

劉玲（1974—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)榛谧杂苫趸磻?yīng)的含脂食品晚期糖基化終產(chǎn)物形成機(jī)理。E-mail：1210197616@qq.com

石飛（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榛谧杂苫趸磻?yīng)的含脂食品晚期糖基化終產(chǎn)物形成機(jī)理。E-mail：2604826491@qq.com