瘦素對HepG2細胞中BSEP蛋白表達及信號通路的影響

何靜宇，雷正明，溫劍，付文廣(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000;巴中市中心醫(yī)院肝膽外科，四川巴中636000)

瘦素對HepG2細胞中BSEP蛋白表達及信號通路的影響

何靜宇1，2，雷正明1△，溫劍1，付文廣1
(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000;2巴中市中心醫(yī)院肝膽外科，四川巴中636000)

目的:探討瘦素(leptin)對人肝癌細胞(HepG2)膽鹽輸出泵(bile saltexport pump，BSEP)蛋白表達及信號通路的影響。方法:體外培養(yǎng)HepG2細胞，不同瘦素濃度(10－8、10－7和10－6mol/L)作為刺激因子，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用Western blotting法檢測HepG2細胞的AMPKa、BSEP蛋白表達及AMPKa磷酸化(p-AMPKa)水平;篩選BSEP蛋白表達的最佳培養(yǎng)時間及瘦素濃度點，加入10μmol/L AMPK阻斷劑compound C進行細胞培養(yǎng)，用Western blotting法檢測BSEP蛋白表達。結(jié)果:(1)不同濃度瘦素干預HepG2細胞72 h時，隨瘦素濃度增高AMPKa蛋白表達量逐漸增高，在瘦素濃度為10－6mol/L時AMPKa蛋白表達最強(P＜0.01);(2)不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h后，AMPKa磷酸化水平與瘦素濃度呈劑量依賴逐漸增強(P＜0.01)，相同瘦素濃度組AMPKa磷酸化水平隨時間逐漸增加(P＜0.01);(3)不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h后，BSEP蛋白表達水平與瘦素濃度呈劑量依賴逐漸增強(P＜0.01)，相同瘦素濃度組BSEP蛋白表達量隨時間逐漸增加(P＜0.01);(4)72 h測得10－6mol/L瘦素組和10－6mol/L瘦素+10μmol/L compound C組BSEP蛋白表達較正常對照組均增加(P＜0.01)，compound C可降低BSEP蛋白的表達(P＜0.01)。結(jié)論:瘦素可通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”途徑促進HepG2細胞BSEP蛋白表達;瘦素可促進HepG2細胞AMPKa蛋白表達及AMPKa磷酸化水平。

肝內(nèi)膽管結(jié)石病;瘦素;膽鹽輸出泵;腺苷酸活化蛋白激酶

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of leptin on the expression of bile salt export pump(BSEP)and signaling pathway in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2.METHODS:HepG2 cells were cultured in vitro.Leptin at concentrations of 10－8，10－7and 10－6mol/L was used as a stimulating factor.The protein levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha subunit(AMPKa)，phosphorylated AMPKa(p-AMPKa)and BSEP in the HepG2 cells at24 h，48 h and 72 h were detected by Western blotting.The optimal culture time and leptin concentration were selected，and compound C at concentration of 10μmol/L was added to this group.The protein expression of BSEP was detected by Western blotting.RESULTS:Intervention of HepG2 cells with leptin for 72 h increased the protein expression of AMPKa gradually in a concentration-dependentmanner，and leptin at concentration of 10－6mol/L induced the strongest AMPKa expression(P＜0.01).Intervention of HepG2 cells with leptin for 24 h increased the phosphorylation level of AMPKa gradually in a dose-dependentmanner(P＜0.01).The effect of leptin on the increase in the protein expression of p-AMPKa was also in a time-dependentmanner(P＜0.01).After intervention with different concentrations of leptin for 24 h，the protein expression of BSEP in the HepG2 cellswas gradually increased by the stimulation of leptin in a concentration-and time-dependentmanner(P＜0.01).Compared with NC group，the protein expression of BSEP in 10－6mol/L leptin group and 10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C group was increased at72 h(P＜0.01)，and that in 10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C group was lower than that in 10－6mol/L leptin group at72 h(P＜0.01).CONCLUSION:Leptin promotes the protein expression of BSEP in HepG2 cells by leptin-AMPK-BSEP signaling pathway.Leptin promotes the increases in AMPKa protein and the level of phosphorylation of AMPKa in HepG2 cells.

［KEY WORDS］Hepatolithiasis;Leptin;Bile salt export pump;Adenosinemonophosphate-activated protein kinase

原發(fā)性肝膽管結(jié)石(hepatolithiasis，HS)主要是膽紅素鈣結(jié)石，其發(fā)生呈明顯地域性分布，好發(fā)于東方國家如中國、日本、韓國等(占同期住院膽石癥病人中的構(gòu)成比4%～52%)，西方發(fā)達國家少見(占同期住院膽石癥病人中的構(gòu)成比0.9%～1.3%)［1］。在我國1994年全國膽石病調(diào)查中肝膽管結(jié)石病例在住院膽石癥病人中的構(gòu)成比為4.7%，較1983～1985年的16.1%有明顯下降［2］，術后殘石率高、復發(fā)率高、再次手術率高并可導致嚴重并發(fā)癥，仍是當今治療難題。HS的發(fā)病機制可能與機體營養(yǎng)狀況、膽道感染、膽道狹窄、膽汁代謝、成分失衡等因素有關，但確切發(fā)病機制尚不明確。研究顯示膽汁中膽汁酸濃度在肝膽管結(jié)石組較正常對照組明顯降低［3］，說明膽汁酸可能在HS的形成中起重要作用。瘦素(leptin)作為腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)活化的上游因子之一，在機體能量代謝及調(diào)控等多方面起重要作用［4］。在我們前期研究中證明瘦素可能在肝膽管結(jié)石形成中起重要作用［5］。近來研究［6］表明AMPK可調(diào)控膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)蛋白的表達，而BSEP是將肝細胞內(nèi)膽汁酸泵入膽小管的重要通道，可調(diào)控膽道膽汁酸的濃度;研究表明，BSEP基因突變的個體對膽石病有易感性［7］。臨床中常用的溶石藥物是熊去氧膽酸，實驗證明其可刺激患者肝臟中BSEP的表達［8］。因此，本課題將探討瘦素對HepG2細胞BSEP蛋白表達的影響及作用機制，進一步從代謝途徑闡述HS的發(fā)病機制并可能為肝膽管結(jié)石提供新的治療方案。

材料和方法

1材料與試劑

人肝癌細胞HepG2購自上海博谷生物科技有限公司;兔抗人AMPKa多克隆抗體和兔抗人phospho-AMPKa(Thr172)多克隆抗體購自CST;山羊抗人BSEP多克隆抗體購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記小鼠抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記小鼠抗山羊IgG購自碧云天生物技術研究所;瘦素多肽購自北京博奧森生物技術有限公司;AMPK阻斷劑compound C購自Sigma。

2細胞培養(yǎng)和實驗分組

用RPMI-1640培養(yǎng)基對HepG2細胞進行細胞培養(yǎng)，用不同濃度(10－6、10－7和10－8mol/L)的瘦素干預，分別于24 h、48 h、72 h時提取蛋白置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?待測出BSEP蛋白表達最強的時間及濃度點，以該濃度leptin+10μmol/L AMPK阻斷劑Compound C進行細胞培養(yǎng)后提取蛋白。

實驗分為正常對照組(NC組:培養(yǎng)基不含leptin)，10－8mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－8mol/L leptin)，10－7mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－7mol/L leptin)，10－6mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－6mol/L leptin)，將各組分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用Western blot檢測BSEP蛋白水平，比較不同時間及l(fā)eptin刺激點，將BSEP表達最強點作為leptin+AMPK阻斷劑組(培養(yǎng)基含10－6mol/L leptin+10μmol/L AMPK阻斷劑compound C)。

3Western blotting檢測AM PKa及BSEP蛋白的表達及AMPKa磷酸化水平

取等量蛋白與相應的蛋白加樣緩沖液進行還原變性的10%SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫下封閉3 h，TBST液漂洗10 min 3次，加入兔抗人AMPKa多克隆抗體(1∶600)、兔抗人phospho-AMPKa(Thr172)多克隆抗體(1∶500)、山羊抗人BSEP多克隆抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，經(jīng)過TBST液嚴格漂洗后，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔II抗(1∶2 000)孵育1 h，再將膜用TBST液徹底漂洗(10 min 3次)后進行ECL化學發(fā)光顯影。結(jié)果用凝膠攝像分析系統(tǒng)Bio-Rad掃描入計算機中，Quantity One凝膠定量分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin條帶的灰度值比值作為蛋白相對表達量，以相對灰度值分析各組之間的差異性。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1瘦素對HepG2細胞AMPKa蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h及48 h，AMPKa蛋白的表達量無明顯變化(P＞0.05)，但在72 h時，隨瘦素濃度增高，AMPKa蛋白的表達量逐漸增高，在瘦素濃度為10－6mol/L時AMPKa蛋白表達最強，同NC組、48 h時10－6mol/L leptin組和72 h時10－7mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The protein expression of AMPKa detected by Western blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs 10－7mol/L leptin group at72 h.圖1　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后AMPKa的蛋白表達

2瘦素作用對HepG2細胞p-AMPKa蛋白水平的影響

Western blotting結(jié)果顯示，24 h測得各組p-AMPK的蛋白水平組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);48 h后AMPKa的磷酸化水平呈時間和劑量依賴逐漸增強，72 h時同NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24 h、48 h和72 h時相同瘦素濃度組p-AMPKa蛋白水平逐漸增加，72 h時10－6mol/L leptin組同24 h、48 h的10－6mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of p-AMPKa detected byWestern blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－7mol/L leptin group at72 h.圖2　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后p-AMPKa的蛋白表達

3瘦素對HepG2細胞中BSEP蛋白表達的影響

24h測得各組BSEP蛋白表達量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);48 h后BSEP蛋白的表達量逐漸增加，48 h時10－6mol/L leptin組及72 h組同NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24 h、48 h和72 h時相同瘦素濃度組的BSEP蛋白表達量逐漸增加，72 h時10－6mol/L leptin組同24 h和48 h的10－6mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of leptin on the protein expression of BSEP detected byWestern blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－7mol/L leptin group at72 h.圖3　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后BSEP的蛋白表達

4AMPK阻斷劑com pund C對HepG2細胞BSEP蛋白表達的影響

72 h測得10－6mol/L leptin組和10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C組的BSEP蛋白表達較NC組均增加(P＜0.05)，10－6mol/L leptin+10 μmol/L compound C組的BSEP蛋白表達較10－6mol/L leptin組降低(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Effects of AMPK inhibitor compound C on leptin-induced the protein expression of BSEP detected by Western blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－6mol/L leptin group.圖4　AMPK阻斷劑com pound C對10－6mol/L瘦素作用的BSEP蛋白表達的影響

討論

瘦素是一種ob基因編碼、主要由白色脂肪細胞合成和分泌，由146個氨基酸組成4條反向平行α鏈連接而成的激素，可減少進食和促進能量消耗在維持能量平衡中起重要作用［9］;其數(shù)量和脂肪細胞含量成正比，血清中游離瘦素能將外周能量信號傳遞至大腦中樞，調(diào)節(jié)進食和能量消耗從而維持能量平衡［10］;瘦素也有廣泛的外周功能，如激活神經(jīng)內(nèi)分泌、促進血管生成和骨形成、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、參與腫瘤形成［11］、肝細胞保護［12］、上調(diào)膽固醇7α-羥化酶(膽汁酸合成關鍵酶)活性［13］及促進蛋白質(zhì)合成等多種生物學功能。

人類BSEP(ABCB11)同P-糖蛋白(P-glycoprotein)、多藥耐藥基因3(multidrug resistance 3，MDR-3)一起均屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP binding cassette transporter，ABC transporter)家族MDR/TAP亞家族成員，由ABCB11基因編碼，位于2號染色體長臂(2q24)，BSEP為含1 321個氨基酸、分子量約160 kD、12個跨膜單環(huán)和2個較大核苷酸結(jié)合區(qū)域構(gòu)成蛋白，并只在肝細胞小管膜側(cè)表達;BSEP蛋白的表達主要受farnesoid X receptor(FXR)、liver receptor homolog 1(Lrh1)和nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)調(diào)控［14-15］。人體BSEP是肝細胞膽鹽轉(zhuǎn)運至膽小管的必須通道，研究表明，ABCB11基因突變的個體顯示出嚴重的肝內(nèi)膽汁淤積，并且膽汁中膽汁酸濃度明顯降低［13］;BSEP亦能轉(zhuǎn)運某些復合物如長春堿、紫杉醇和鈣黃綠素等［16］。人類BSEP結(jié)構(gòu)或功能異常后可發(fā)展為嚴重的肝臟疾病如進展型家族性肝內(nèi)膽汁淤積2型、良性復發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、肝細胞癌［17］及膽石癥［7，16］等。因此，促進BSEP蛋白的表達，可為其導致的相關疾病找到新的治療方法。Chopra等［6］報道AMPK可通過“AMPK-SRC2-FXR-BSEP”信號通路調(diào)控BSEP蛋白表達。雖然瘦素可激活肝臟中AMPK活性，且AMPK促進BSEP蛋白表達，但瘦素是否影響B(tài)SEP蛋白合成，是否通過“l(fā)eptin-AMPK-SRC2-FXR-BSEP”通路影響B(tài)SEP蛋白表達目前尚無相關研究。本實驗將HepG2細胞進行體外培養(yǎng)，用不同濃度的瘦素干預(培養(yǎng)基含10－8、10－7和10－6mol/L leptin)，分別于24 h、48 h、72 h用Western blot法檢測AMPKa、p-AMPKa及BSEP蛋白水平，以了解瘦素對BSEP蛋白表達的影響。在瘦素對BSEP蛋白表達刺激最強時間(72 h)和濃度(10－6mol/L)的條件下加入AMPK阻斷劑Compound C后用Western blotting法檢測BSEP蛋白的水平，以說明瘦素是否通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”通路影響B(tài)SEP蛋白表達。結(jié)果顯示在瘦素干預HepG2細胞后雖然AMPKa的變化趨勢不明顯，但其活化形式p-AMPKa同BSEP有相似的變化趨勢;10－6mol/L leptin組和10－6mol/L瘦素+10μmol/L Compound C組BSEP蛋白表達水平較正常組均有所升高，但10－6mol/L leptin+10 μmol/L Compound C組較10－6mol/L leptin組明顯降低，且10－6mol/L瘦素+10μmol/L Compound C組較NC組的BSEP蛋白表達有所升高，提示瘦素主要通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”通路促進HepG2細胞的BSEP蛋白表達，但是否存在其它調(diào)節(jié)HepG2細胞表達BSEP蛋白的通路，有待進一步探討。綜上所述，瘦素可能通過“l(fā)eptin-AMPK-SRC2-FXR-BSEP”信號通路促進HepG2細胞的BSEP蛋白表達，可為HS的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和新的治療途徑。

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Effects of leptin on BSEP protein expression and signaling pathway in HepG2 cells

HE Jing-yu1，2，LEIZheng-ming1，WEN Jian1，F(xiàn)UWen-guang1
(1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China;2Department of Hepatobiliary Surgery，Central Hospital of Bazhong City，Bazhong 636000，China.E-mail:leizhm@medmail.com.cn)

R730.23;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.019

1000-4718(2015)05-0877-05

2014-10-22

2015-01-23

Tel:0830-3165903;E-mail:leizhm@medmail.com.cn