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    支原體污染經(jīng)p38 MAPK途徑降低人類細(xì)胞株28S和18S RNC-rRNA*

    2015-11-08 02:28:16羅彥彰林修賢榮冬秀崔毅峙
    中國(guó)病理生理雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:核糖體細(xì)胞株條帶

    王 青, 羅彥彰, 林修賢, 榮冬秀, 張 濤, 王 通, 崔毅峙

    細(xì)胞體外培養(yǎng)模型是病理生理研究中不可或缺的工具,然而,實(shí)驗(yàn)室支原體污染在世界范圍內(nèi)廣泛流行,其在體外組織培養(yǎng)的污染率高達(dá)5% ~35%[1-2]。支原體是已知最小的原核生物,直徑多為0.1 ~0.3 μm,能夠通過(guò)除菌濾膜(0.22 μm),其唯一可見(jiàn)的細(xì)胞器是核糖體。受非致病性支原體污染的細(xì)胞株往往沒(méi)有明顯的形態(tài)或培養(yǎng)基變化[3],因而常被忽視。但是,科研界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)是,以有支原體污染的組織培養(yǎng)模型得到的科學(xué)結(jié)論被認(rèn)為是假象。

    我們?cè)谝酝墓ぷ髦谐晒⒘苏婧思?xì)胞翻譯組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究平臺(tái),并利用該策略闡明了在穩(wěn)態(tài)腫瘤細(xì)胞中存在長(zhǎng)度依賴的翻譯偏好現(xiàn)象,以及闡述了這種偏好與腫瘤細(xì)胞的表型密切相關(guān)[4]。該策略的技術(shù)內(nèi)核是人細(xì)胞的核糖體新生肽鏈復(fù)合物(ribosome nascent-chain complex,RNC)的分離和提取,從而研究RNC結(jié)合的翻譯中mRNA(RNC-mRNA)的組學(xué)規(guī)律。RNC中包含的是已裝配完畢的成熟核糖體。

    Levine等[5]曾報(bào)道支原體感染會(huì)引起總RNA組分中的核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)相對(duì)含量的改變。我們實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)支原體污染的細(xì)胞總RNA組分改變并不顯著,然而成熟核糖體中RNC-rRNA的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。由于支原體富含核糖體且具改變細(xì)胞表型能力,我們假設(shè)支原體污染會(huì)引起宿主細(xì)胞的RNC-rRNA組成發(fā)生改變。回答該問(wèn)題不但可在翻譯層面闡述支原體輸入對(duì)人細(xì)胞的影響,同時(shí)可探索RNC-rRNA作為支原體污染檢測(cè)的可行性;進(jìn)而,也有望為評(píng)價(jià)支原體污染臨床治療的療效提供一條新途徑。因此,本研究利用RNC分離技術(shù)從人類細(xì)胞株中分離得到成熟的核糖體,并研究實(shí)驗(yàn)室支原體污染對(duì)RNC-rRNA組成的改變,并初步探索了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑在該過(guò)程中的可能作用。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 主要材料 HBE、H1299和 A549細(xì)胞購(gòu)自ATCC;Hep3B、HCCLM3、HCCLM6 細(xì)胞來(lái)自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院;超速離心機(jī)及SW60 Ti轉(zhuǎn)子購(gòu)自Beckman;瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京市六一儀器廠;SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad,PVDF膜購(gòu)自Millipore。

    1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco,瓊脂糖購(gòu)自 Invitrogen;KCl、MgCl2、HEPES、KOH 和蔗糖購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;放線菌酮(cycloheximide,CHX)和SDS裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DTT購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司;Triton X-100購(gòu)自Sigma;支原體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司;ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK 和p-JNK抗體購(gòu)自CST,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和Ⅱ抗購(gòu)自Bioworld。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE、A549、H1299、Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞按照我們已發(fā)表的方法進(jìn)行培養(yǎng)[4,6]。

    2.2 支原體污染的治療 根據(jù)文獻(xiàn)[7]方法,在被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入環(huán)丙沙星,終濃度為10 mg/L,連續(xù)傳代培養(yǎng)7代后進(jìn)行再次檢驗(yàn)。

    2.3 支原體的PCR檢測(cè) 依照支原體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR檢測(cè)。用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上。取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清,放入離心管中。13 000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS洗沉淀1次。加入100 μL裂解液裂解細(xì)胞,上下顛倒混勻后,室溫放置5 min。細(xì)胞裂解液95℃處理5 min。13 000 r/min離心5 min,上清轉(zhuǎn)入新離心管。取2 μL上清作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng):95℃ 30 s;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

    2.4 真核細(xì)胞RNC提取 依照我們發(fā)表的方法提取真核細(xì)胞RNC[4]。細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d后,在培養(yǎng)基中加入CHX,至終濃度100 mg/L,放入培養(yǎng)箱中孵育15 min。將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至冰上,棄去上清,用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次。在瓶中加入500 μL裂解液(20 mmol/L HEPES-KOH,15 mmol/L MgCl2,200 mmol/L KCl,100 mg/L CHX,2 mmol/L DTT和1%Triton X-100,置于冰上裂解30 min。刮下細(xì)胞,收集裂解液,16 200 ×g,4℃離心10 min。在超速離心管中加入30%蔗糖溶液2 mL,沿管壁緩慢加入細(xì)胞裂解液500 μL(蔗糖與裂解液比例不得小于3∶1)。185 000 ×g,4 °C 離心3 h,棄上清,用100 μL Buffer RB(20 mmol/L HEPES-KOH,15 mmol/L MgCl2,200 mmol/L KCl,100 mg/L CHX,2 mmol/L DTT)重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中。2.5 RNC-RNA提取 用TRIzol Reagent提取RNCRNA。在2.4中得到的RNC中加入1 mL TRIzol Reagent,充分混勻后室溫靜置3 min。加入200 μL氯仿,渦旋混勻15 s,室溫靜置5 min。12 000×g,4℃離心15 min,溶液分為3層,小心吸取水相層,轉(zhuǎn)移至新的EP管中,加入1倍體積的異丙醇,混勻后-20℃靜置過(guò)夜。12 000 ×g,4℃離心30 min,用-20℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀物2次,風(fēng)干乙醇后加入 30 μL RNase-free H2O。

    2.6 瓊脂糖凝膠電泳 以標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNC-RNA,凝膠濃度為2%,每孔上樣量為1 μg,90 V電泳約1 h。用 SYBR-Green II染色后用290 nm紫外光激發(fā)照相獲取RNC-RNA條帶圖譜。2.7 Western blot 細(xì)胞樣品用SDS裂解液裂解提取總蛋白,10%SDS-PAGE分離蛋白,濃縮膠中60 V電泳30 min,分離膠中80 V電泳2 h。取出凝膠,以230 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。5% 脫脂牛奶封閉1 h,Ⅰ抗以1∶1 000稀釋,4℃過(guò)夜,Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h,顯影。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    瓊脂糖凝膠電泳圖在ImageJ軟件中測(cè)定各泳道內(nèi)各截面的總灰度值[8];數(shù)據(jù)以Matlab R2013a軟件分析并作圖。Western blot實(shí)驗(yàn)中,用ImageJ軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值對(duì)目的條帶灰度值歸一化,使用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。我們采用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)以排除不同膠片曝光參數(shù)不同帶來(lái)的誤差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 支原體污染對(duì)H1299和A549細(xì)胞的RNC-rRNA組成影響

    我們以PCR方法分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的2株肺來(lái)源癌細(xì)胞株H1299和A549進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示該H1299細(xì)胞呈支原體陰性(表現(xiàn)為280 bp條帶陰性,150 bp條帶陽(yáng)性),而A549細(xì)胞受支原體污染(280 bp和150 bp條帶雙陽(yáng)性)。我們分別提取了這2株細(xì)胞的RNC并從中分離出RNC-RNA,瓊脂糖凝膠電泳圖顯示,支原體陰性細(xì)胞株H1299具有清晰的28S(~4 700 nt)和18S(~1 900 nt)條帶,為典型真核生物rRNA帶型;相反,A549細(xì)胞RNC-rRNA帶型發(fā)生明顯改變,28S條帶灰度值明顯下降,同時(shí)在約1 540 nt處出現(xiàn)典型的原核生物16S rRNA特征性條帶,此外在約700 bp處出現(xiàn)1條來(lái)源不明的條帶,以下稱Unknown條帶。灰度分析表明,支原體陽(yáng)性細(xì)胞RNC-RNA中28S和18S rRNA條帶所占比例大幅減少,相反16S rRNA和Unknown條帶所占比例明顯上升,見(jiàn)圖1。

    Figure 1.Decreases in 28S and 18S rRNA in the RNC-RNA fraction of mycoplasma-contaminated human H1299 and A549 cells.圖1 支原體污染降低人肺癌H1299和A549細(xì)胞株RNC-RNA中的28S和18S rRNA

    2 RNC-rRNA組成變化的獲得性實(shí)驗(yàn)

    我們進(jìn)而利用本實(shí)驗(yàn)室專用于培養(yǎng)已知有支原體污染的培養(yǎng)箱模擬細(xì)胞的獲得性支原體感染,并研究RNC-rRNA在此模型中的改變,從而探索RNC-rRNA組成改變的特異性,以及用于檢測(cè)支原體污染的實(shí)用性。我們復(fù)蘇了支原體陰性的HBE細(xì)胞,其初始階段提取的RNC-RNA結(jié)果表現(xiàn)為正常的rRNA帶型以及正常的rRNA條帶的灰度值。在存在支原體污染的培養(yǎng)環(huán)境中,未進(jìn)行抗支原體處理經(jīng)4次細(xì)胞傳代后,再次收集該 HBE細(xì)胞提取的RNCRNA,電泳圖顯示細(xì)胞內(nèi)成熟核糖體rRNA組成發(fā)生與圖1相似的變化,其灰度值分析出現(xiàn)了16S和Unknown條帶,見(jiàn)圖2。這表明我們可有效利用RNC-rRNA帶型發(fā)現(xiàn)支原體的獲得性污染。

    Figure 2.Acquired mycoplasma contamination of HBE cells.MP-:mycoplasma negativa;MP+:mycoplasma positive.圖2 HBE細(xì)胞的獲得性支原體污染

    3 抗支原體治療可逆轉(zhuǎn)RNC-rRNA組成的變化

    隨后,我們?cè)噲D回答,抗支原體治療是否可逆轉(zhuǎn)RNC-rRNA的異常組成,以進(jìn)一步輔助證明支原體對(duì)翻譯影響的特異性。因此,我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)多個(gè)不同組織來(lái)源的細(xì)胞株進(jìn)行了測(cè)試。在肺癌A549中,支原體陽(yáng)性細(xì)胞的RNC-RNA提取結(jié)果均顯示出異常的成熟核糖體rRNA組分;然而,經(jīng)治療RNC-rRNA的帶型逆轉(zhuǎn)為正常,表現(xiàn)為16S和Unknown條帶的消失,以及真核28S和18S條帶的灰度值恢復(fù)。在支原體陽(yáng)性的肝癌Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞中,我們也觀察到了異常的RNC-rRNA條帶和灰度值改變;經(jīng)抗支原體治療,這些異常RNC-rRNA恢復(fù)為正常狀態(tài),見(jiàn)圖3。

    Figure 3.Anti-mycoplasma treatment reversed the mycoplasma-mediated aberrant RNC-rRNA compositions.圖3 抗支原體治療后恢復(fù)人細(xì)胞株RNC-rRNA的組成

    4 支原體污染影響宿主細(xì)胞MAPK通路

    支原體感染可通過(guò)活化多種真核宿主細(xì)胞的MAPK途徑[9],并可介導(dǎo) 28S rRNA的合成和降解[10]。為此,我們選擇了2株經(jīng)過(guò)檢測(cè)分別確證為支原體陰性與陽(yáng)性的肺癌A549細(xì)胞,提取其全蛋白,并以Western blot檢測(cè)其中MAPK通路激活狀態(tài)改變。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與支原體陰性的細(xì)胞相比,受支原體污染的A549細(xì)胞中,總p38和磷酸化p38比率(p38/p-p38)顯著升高(P<0.01),而(ERK1/2)/(p-ERK1/2)比率無(wú)顯著變化(P>0.05)。這表明p38 MAPK途徑在支原體感染下受到抑制,而ERK途徑不受影響。同時(shí),Western blot結(jié)果顯示A549細(xì)胞的JNK蛋白表達(dá)量在檢測(cè)精度以下,見(jiàn)圖4。

    Figure 4.Mycoplasma infection altered the MAPK signaling pathway in A549 cells.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs MP-.圖4 支原體污染對(duì)A549細(xì)胞MAPK通路的影響

    討 論

    支原體對(duì)宿主細(xì)胞核糖體rRNA的影響曾被多次報(bào)道[11],這些研究主要利用高靈敏度的放射自顯影方法證明宿主細(xì)胞內(nèi)存在低豐度的原核生物特征性16S和23S rRNA[12]。鑒于支原體污染具普遍性[13],且目前常規(guī)細(xì)胞總RNA提取和凝膠檢測(cè)結(jié)果中上述原核生物特征性條帶并不常見(jiàn),原因是在細(xì)胞水平上支原體所產(chǎn)生的原核核糖體在數(shù)量上并無(wú)優(yōu)勢(shì)。相反,本研究通過(guò)蔗糖緩沖離心分離出成熟的核糖體[4],發(fā)現(xiàn)在支原體污染樣品中,原核特征性rRNA條帶所占比例明顯增加,該現(xiàn)象表明宿主細(xì)胞內(nèi)原核核糖體在成熟核糖體組分中所占比例明顯上升。

    細(xì)胞內(nèi)核糖體的裝配與蛋白質(zhì)翻譯這一過(guò)程受嚴(yán)格調(diào)控,目前已知真核細(xì)胞內(nèi)參與核糖體裝配的因子有170種以上[14]。同樣,支原體誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生廣泛而深刻的改變[3],因此,我們認(rèn)為支原體完全可能具干擾宿主細(xì)胞的核糖體裝配的潛力,但目前尚無(wú)直接證據(jù)支持這一假說(shuō)。作為該假說(shuō)的支持證據(jù),本研究觀測(cè)到不同細(xì)胞株中各rRNA條帶所占比例差異較大,部分支原體陽(yáng)性樣品中真核生物rRNA特征性條帶灰度值與背景值相近。由于在核酸總量上支原體陽(yáng)性樣本與陰性樣本一致,可排除分離能力飽和的可能性。此外,在部分樣品中出現(xiàn)高豐度的Unknown條帶,膠圖上指示該條帶長(zhǎng)度(約700 bp,相當(dāng)于1 400 nt)與目前已知的真核或原核生物rRNA長(zhǎng)度均不一致,提示其中可能存在新的核糖體組裝方式。

    上述現(xiàn)象在常規(guī)的總RNA提取中難以發(fā)現(xiàn),因此,本研究結(jié)果首次報(bào)道了支原體污染中,人類細(xì)胞的28S和18S RNC-rRNA下降的現(xiàn)象。MAPK通路是細(xì)胞中多種生物進(jìn)程的重要調(diào)控因素[15-16],且MAPK通路改變被認(rèn)為與rRNA的合成和降解有機(jī)制聯(lián)系[10]。我們?cè)诒狙芯恐兴屑?xì)胞株均發(fā)現(xiàn)了相同的RNC-rRNA變化,并進(jìn)而以A549細(xì)胞為例證展開(kāi)了研究。我們的結(jié)果驗(yàn)證了支原體污染介導(dǎo)的p38 MAPK途徑抑制與28S和18S RNC-rRNA降低的關(guān)系。其實(shí),真核細(xì)胞rRNA合成高度依賴細(xì)胞外成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1(fibroblast growth factor 1,F(xiàn)GF1)和FGF-2的入胞和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位[17]。其中,核內(nèi)FGF-2更可與上游結(jié)合因子(upstream binding factor,UBF)形成復(fù)合體,直接發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能以介導(dǎo)rRNA轉(zhuǎn)錄[18]。FGF-1和FGF-2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位已知高度依賴p38 MAPK途徑的活化[17]。因此,本研究機(jī)制部分可歸納為,支原體感染可抑制p38磷酸化,進(jìn)而阻斷FGF-1和FGF-2入核,從而降低rRNA的合成,最終影響RNC-rRNA的組成。

    由于支原體感染的隱蔽性與感染清除的復(fù)雜性,目前對(duì)受感染細(xì)胞株的首選處理方式是進(jìn)行庫(kù)存替換[19],實(shí)際科研工作中對(duì)支原體感染以預(yù)防為主,故需要簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)手段對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞污染情況進(jìn)行定期檢查。目前常用的支原體檢測(cè)方法有 PCR 法[20]、ELISA 法[21]和核酸染色法[22],其中PCR法以其較高的準(zhǔn)確率與相對(duì)較低的成本和耗時(shí)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)中[23]。然而PCR法與ELISA法均依賴于已知的病原體信息,因而在理論上存在檢測(cè)盲區(qū)。本研究所用的方法在原理上不存在上述檢測(cè)盲區(qū),同時(shí)成本低廉、操作簡(jiǎn)便,能夠成為支原體檢測(cè)的輔助手段。

    綜上,本研究首次報(bào)道了支原體污染對(duì)人細(xì)胞株成熟核糖體rRNA組成的影響,并在A549細(xì)胞中驗(yàn)證了p38 MAPK在其中扮演重要角色。因此,本研究為支原體感染狀態(tài)下真核細(xì)胞的病理生理研究提供了一定的方向指引。同時(shí)本研究所用的方法與已有支原體檢測(cè)手段相比具有一定優(yōu)勢(shì),可開(kāi)發(fā)為新的支原體檢測(cè)手段。

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