生鮮乳檢測技術(shù)的研究進展

杜兵耀　臧長江　馬晨　李昊　楊開倫　余雄

摘 要：優(yōu)質(zhì)的生鮮乳是奶業(yè)發(fā)展的必然方向，而生鮮乳中乳脂率、乳蛋白率、菌落總數(shù)和體細胞數(shù)是衡量優(yōu)質(zhì)乳的核心指標(biāo)， 這些指標(biāo)既關(guān)系到質(zhì)量安全與消費者的健康，又決定著牛奶的經(jīng)濟價值與核心競爭力，其中乳脂肪和乳蛋白的含量與組成是牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，菌落總數(shù)是環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)，體細胞數(shù)是奶牛健康狀況指標(biāo)。近年來，國內(nèi)外牛奶質(zhì)量安全事件頻發(fā)，嚴(yán)重威脅人類健康。筆者通過對生鮮乳的檢測技術(shù)的文獻研究，提出相應(yīng)的建議，這對提高生鮮乳質(zhì)量安全以及保證人們的身體健康和生命安全具有十分重要的意義。

關(guān)鍵詞：生鮮乳；檢測技術(shù)；質(zhì)量安全

中圖分類號：TS252.7 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.018

Research Progress on Testing Technology of Fresh Milk

DU Bing-yao， ZANG Chang-jiang， MA Chen， LI Hao， YANG Kai-lun， YU Xiong

（College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830052， China）

Abstract： High-quality fresh milk is the inevitable direction of developing dairy industry， while butterfat rate， milk protein rate， the total number of colonies and the number of somatic cells in fresh milk are the core indicators of measuring high-quality milk. It involves both the quality and safety and the health of consumers， and decides the economic value and the core competitiveness of milk. The milk fat and milk protein content and composition are the main material basis of milk nutrition quality and the total number of colonies is an indicator of environmental health and the number of somatic cells is the cow health indicator. In recent years， milk quality security incidents at home and abroad occur frequently， posing a serious threat to human health. In this paper， based on the literature research of testing technology of the fresh milk， the corresponding proposal is put forward to improve the quality and safety of fresh milk and ensure people's health and life safety.

Key words： fresh milk； testing technology； quality and safety

近幾年牛奶質(zhì)量安全事件時有發(fā)生，尤其是2008年發(fā)生的“三鹿奶粉事件” ，2009 年底又出現(xiàn)多起奶制品三聚氰胺超標(biāo)案件，生鮮乳質(zhì)量安全已經(jīng)成為決定我國奶制品行業(yè)生死存亡的問題[1]。國家采取各項檢測措施不斷加強生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)管，體制更加健全，保障更加有力，也取得了明顯效果。本研究主要從霉菌毒素、藥物殘留、體細胞數(shù)和菌落總數(shù)等方面進行綜述[2]。

1 生鮮乳霉菌毒素的檢測技術(shù)

霉菌毒素污染是食品質(zhì)量安全的重要問題，對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。目前，世界各國已經(jīng)開始積極檢測牛奶中霉菌毒素的污染狀況，大約有20種在食品和飼料中的含量較為顯著，其中的玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬菌素、赭曲霉毒素等因具有高毒性和致癌性而備受關(guān)注。目前檢測霉菌毒素的方法主要有酶聯(lián)免疫法、薄層層析法、高效液相色譜法、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[3]。

1.1 酶聯(lián)免疫法在生鮮乳霉菌毒素檢測中的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫法是當(dāng)今最具代表性的快速、高效的檢測方法，且方法簡單易于操作，被廣泛應(yīng)用于霉菌毒素分析檢測[4]，但由于該方法易出現(xiàn)假陽性等缺點限制了其進一步應(yīng)用[5]。

1.2 薄層層析法在生鮮乳霉菌毒素檢測中的應(yīng)用

薄層層析法（TLC）是對霉菌毒素進行定性或定量檢測的方法[6]，濃縮后的待測樣品提取液通過單向展開法在薄層上分離后， 對霉菌毒素的 Rf值和熒光顏色進行觀察分辨， 再根據(jù)薄層色譜板上顯示熒光的最低檢出量進行定量。利用薄層色譜法檢驗得出的結(jié)果準(zhǔn)確， 操作方法簡單，但該方法運用的試劑多， 檢驗周期較長。

1.3 高效液相色譜法在生鮮乳霉菌毒素檢測中的應(yīng)用

高效液相色譜法較早用于霉菌毒素的檢測，經(jīng)常用的檢測器主要有熒光、二極管陣列、紫外等檢測器，是目前使用較為廣泛的霉菌毒素的檢測方法。采用高效液相-熒光檢測法檢測生鮮乳中赭曲霉素A，樣品可以跳過液-液提取的步驟，濃縮后經(jīng)過免疫親和柱洗脫，進行檢測，不需要使用有毒試劑（有機氯等）。采用高效液相-熒光檢測法時，被檢測物要具有很好的熒光特性。該方法易于操作、靈敏性高，但是只能檢測一類或者一種霉菌毒素。

1.4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在生鮮乳霉菌毒素檢測中的應(yīng)用

隨著液質(zhì)聯(lián)用法的不斷發(fā)展和完善，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、特異性強、選擇性高等特點已成為霉菌毒素分析最普遍的方法。利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可同時測定生鮮乳中黃曲霉毒素M1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1等多種霉菌毒素。但是該方法具有儀器設(shè)備比較昂貴、可信性差、檢測成本高等缺陷，有待改進。

2 生鮮乳中藥物殘留的檢測技術(shù)

在獸醫(yī)臨床上常用藥物治療奶牛的各種疾病，而由此引起的藥物殘留是一個全球性的問題。藥物在生鮮乳中的殘留會通過食物鏈傳播，從而嚴(yán)重危害人類的健康。生鮮乳中藥物殘留的檢測是保證生鮮乳質(zhì)量安全的重要環(huán)節(jié)，因此建立對生鮮乳中藥物的定性定量檢測方法十分重要。藥物殘留主要包括激素類藥物殘留、農(nóng)藥殘留、抗生素等。

2.1 生鮮乳中激素類藥物殘留的檢測技術(shù)

激素類藥物（Hormone drugs）是把人體或動物激素（包括與激素結(jié)構(gòu)、作用原理相同的有機物）作為有效成分的藥物。在奶牛飼養(yǎng)過程中，為了促進奶牛生長、提升牛奶的產(chǎn)量，奶農(nóng)會違規(guī)使用激素類藥物，從而導(dǎo)致牛奶中激素的殘留。當(dāng)機體攝入含有激素類藥物的生鮮乳后，殘留的激素會對機體的健康構(gòu)成很大的威脅，殘留的激素中生長激素、甲狀腺激素和性激素對機體造成的影響最大。當(dāng)食用的生鮮乳或其制品殘留有性激素時，會增加患更年期乳腺癌或者前列腺癌的幾率。在檢測生鮮乳中激素類藥物殘留時，因為激素類藥物結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)相近，其殘留程度和生理水平接近，所以對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性要求較高，并且需要高度靈敏的分析設(shè)備和有效的樣品前處理。因此需要利用可靠的檢測技術(shù)來測定生鮮乳中激素類藥物的殘留。目前，生鮮乳中的激素類藥物殘留的檢測方法主要分為免疫分析法和色譜質(zhì)譜分析法[7]。

2.1.1 免疫分析法檢測生鮮乳中激素類藥物的殘留 免疫分析法是利用抗體和抗原的特異性結(jié)合來檢測生鮮乳中激素類藥物殘留的方法，可分為酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）和放射免疫分析法（RIA）。酶聯(lián)免疫分析法可以滿足生鮮乳中激素殘留的檢測要求。但是該方法的檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，當(dāng)出現(xiàn)初篩陽性結(jié)果時要用其他方法驗證。放射免疫分析法，是將靈敏度高的放射性示蹤技術(shù)和特異性很高的免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，可以對微量的生理活性物質(zhì)進行檢測定量，該方法將免疫分析和放射性標(biāo)記相結(jié)合，可以對極其微量的生物活性物質(zhì)進行檢測，具有一定的優(yōu)越性且樣品處理簡單，具有高度的特異性和靈敏性，但是該方法作為單一的測定方法只可以檢測幾種特定的激素類藥物，且其半衰期較短，并具有少量輻射，從而限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

2.1.2 色譜質(zhì)譜分析法檢測生鮮乳中激素類藥物的殘留 色譜法主要是依據(jù)待測樣品在相應(yīng)相態(tài)的合理性分配、吸附、交換、排斥滲透等性質(zhì)的不同，達到分離的作用，然后順序檢測各組的含量。主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、 高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[8]。氣相色譜法（GC）是以氣體作為流動相的柱色譜分離分析方法，氣象色譜分析具有高度的靈敏性和很強的選擇性，操作簡單，但是該方法使用的樣品需要氣化，定性能力差，應(yīng)用范圍受到限制。氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分離效能高，選擇性好，靈敏度高，定量和定性能力強，但是該方法使用時，樣品前處理要求高、衍生過程繁瑣、樣品需要氣化、設(shè)備昂貴且使用范圍有限。高效液相色譜法（HPLC）分辨率高、速度快、使用范圍廣，但是該方法分離效率低、定性能力差、色譜柱易污染。液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）不需對目標(biāo)物進行衍生處理，速度快檢測限低，操作簡便，而且靈敏度高，測量范圍廣，但是該方法對樣品前處理要求高，設(shè)備昂貴。除以上目前所普遍使用的方法外，隨著科技的進步，許多新的免疫技術(shù)逐步被開發(fā)并應(yīng)用于藥物殘留的檢測，如熒光偏振免疫法、膠體金免疫法、時間分辨熒光法、動注射免疫法。

2.2 生鮮乳中獸藥殘留的檢測技術(shù)

獸藥在畜牧業(yè)的大量應(yīng)用，不可避免地造成生鮮乳中藥物的殘留。通過食物鏈被人們長時間的攝入后，會對人體健康產(chǎn)生較大的危害，主要表現(xiàn)以下幾個方面：（1）有些人對抗生素過敏，攝入含有抗生素的生鮮乳時會產(chǎn)生不同程度的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的會危及生命；（2）長期攝入含有抗生素的生鮮乳等于長期攝入了低劑量的抗生素，會使機體內(nèi)的細菌產(chǎn)生耐藥性；（3）生鮮乳中殘留獸藥會影響其品質(zhì)，同時也影響其本身的發(fā)酵，使其深加工產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量降低，給生產(chǎn)者造成經(jīng)濟損失。

隨著生鮮乳獸藥殘留問題變得日益嚴(yán)重，獸藥殘留檢測技術(shù)也得到全面的發(fā)展。目前，有關(guān)生鮮乳中檢測獸藥殘留的主要方法有：免疫分析法、微生物檢測法[9]。

2.2.1 免疫分析法在生鮮乳獸藥殘留的檢測中的應(yīng)用 根據(jù)標(biāo)記物的不同，將免疫分析法分為酶聯(lián)免疫分析法、放射性免疫分析法、熒光免疫分析法、免疫層析法等[10]。目前用于檢測獸藥殘留的免疫分析方法主要有兩類：一類是把抗原抗體識別作為核心反應(yīng)，主要是酶聯(lián)免疫吸附法，另一類是以受體配體識別作為核心反應(yīng)，利用配體受體間的特異性來進行檢測的方法，該方法變異系數(shù)低，靈敏度高。

2.2.2 微生物檢測法在生鮮乳獸藥殘留的檢測中的應(yīng)用 微生物檢測法又稱微生物抑制試驗（MIT），是最早應(yīng)用于檢測生鮮乳中抗生素的方法，是依據(jù)抗生素對微生物生理機能和代謝的抑制作用來定量或者定性地確定樣品中的抗生素殘留[11]。常用的微生物檢測技術(shù)有杯碟法（CP）、紙片法（PD）、氧化三苯基四氮唑法（TTC）[12]。生鮮乳中獸藥殘留的檢測以氧化三苯基四氮唑法（TTC）和紙片法（PD）為主。氧化三苯基四氮唑法是為定性檢測生鮮乳中獸藥殘留的方法，該方法簡單、無特殊設(shè)備，但用該方法檢測較為耗時[13]。紙片法（PD）常用的方法有枯草桿菌紙片檢測法和嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法[8]?？莶輻U菌紙片檢測法是將濾紙圓片吸滿待測乳樣后放在接種枯草桿菌的瓊脂平皿上，然后放入一個含有標(biāo)準(zhǔn)抗生素的陽性對照圓片。將培養(yǎng)皿置于32 ℃下培養(yǎng)17～24 h后，觀察有無抑菌圈的出現(xiàn)，為了確定陽性物質(zhì)是否是青霉素，需對加熱后的乳樣用青霉素酶處理，來滅活乳樣中的青霉素，然后再進行檢測。該方法檢測的結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，且耗時較長[12]。

2.3 生鮮乳中農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)

眾所周知，農(nóng)藥是人們向環(huán)境中投放的數(shù)量大、毒性廣的一類屬于毒害性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，最終直接暴露在生態(tài)環(huán)境中。殘留、富集是農(nóng)藥不可避免的環(huán)境行為。因此，農(nóng)藥殘留是造成食品質(zhì)量安全問題的重要因素之一，其化學(xué)成分對人體具有較大的毒害性，同時人們也一直重視生鮮乳的農(nóng)藥殘留問題。農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)是對復(fù)雜混合物的微量組分進行準(zhǔn)確分析的技術(shù)，此項技術(shù)要求微量操作手段，特異性強，靈敏度高。由于農(nóng)藥品種多，性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)形式多樣且其組成成分復(fù)雜，有些農(nóng)藥還需要對其降解物進行檢測。農(nóng)藥的轉(zhuǎn)換物和代謝物等也給生鮮乳中農(nóng)藥殘留的檢測提出了更高的要求，需要靈敏度高、可行性好的檢測技術(shù)。目前農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)常用的方法有儀器分析法、免疫分析法、酶抑制法、生物傳感器法等[13]。

2.3.1 儀器分析法在生鮮乳農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 氣相色譜、液相色譜分析法是實驗室檢測生鮮乳中農(nóng)藥殘留最常規(guī)的方法[14-15]，此外，還有色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/HPLC-MS）、 SFC等高效快速檢測技術(shù)已進入實用階段。氣相色譜法（GC）是目前應(yīng)用最為廣泛的方法，大約70 %的農(nóng)藥殘留檢測是用氣相色譜法來進行的。超臨界流體色譜法是用超臨界流體為流動相的檢測技術(shù)，能彌補氣相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的不足。儀器分析方法未大量用于生鮮乳的現(xiàn)場檢測，由于其對操作人員要求相對較高，儀器較為昂貴等缺點，使該方法的應(yīng)用受到了限制。

2.3.2 免疫分析法在生鮮乳農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 生鮮乳中農(nóng)藥殘留檢測常用的免疫分析法有放射性免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和熒光免疫分析法。由于熒光免疫分析法存在非特異性問題，放射免疫分析法污染環(huán)境，盡管這兩種方法靈敏度高，但是它們的技術(shù)程序較為復(fù)雜，需要特殊的儀器設(shè)備，因而限制它們的廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)免疫法操作簡單，但是該方法易出現(xiàn)假陽性且不適用于大量樣品的分析。

2.3.3 酶抑制法在生鮮乳農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 酶抑制法是較為成熟的一種生鮮乳中農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)。酶抑制法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生鮮乳中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場檢測，成為儀器分析法的有效補充方法。雖然目前酶抑制法只能對有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行測定，但仍是生鮮乳中農(nóng)藥殘留快速檢測的首選方法之一。酶抑制法的優(yōu)點是快速、操作方法簡單、無需儀器或儀器較為簡單，適用于現(xiàn)場的定性和半定量測定及多樣品的篩選檢測。但該方法只適用于部分農(nóng)藥的快速檢測，并且其靈敏度和所使用的酶、顯色反應(yīng)的時間和溫度都有密切的關(guān)系，因此具有一定的局限性。

2.3.4 生物傳感器在生鮮乳農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 生物傳感器是目前農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)中的研究熱點，使用該方法檢測的樣品一般不需要前期處理，也不需要另外添加其它的試劑；樣品的檢測和被測成分的分離可以同時完成；可以實現(xiàn)對待測樣品的實時監(jiān)測和自動化的測量；樣品的需要量少，并且可反復(fù)多次使用。但是生物傳感器檢測的重現(xiàn)性和結(jié)果穩(wěn)定性存在著問題，影響了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

3 生鮮乳中體細胞數(shù)和菌落總數(shù)的檢測技術(shù)

生鮮乳體細胞數(shù)（SCC）是指每毫升生鮮乳中所含的體細胞個數(shù)[16]。體細胞數(shù)是劃分生鮮乳的品質(zhì)、保證乳制品質(zhì)量安全、診斷奶牛的乳房炎和檢測奶牛飼養(yǎng)管理水平的重要參考指標(biāo)。菌落總數(shù)（TBC）是指每毫升生鮮乳中含有的細菌個數(shù)。生鮮乳中的菌落總數(shù)是衡量生鮮乳質(zhì)量安全的一個重要指標(biāo)，它反映了生鮮乳質(zhì)量的優(yōu)劣。因此體細胞數(shù)和菌落總數(shù)的檢測具有很重要的意義。目前生鮮乳體細胞檢測常用的方法主要有鏡檢計數(shù)法、庫爾特計數(shù)儀測定法、加利福尼亞細胞數(shù)測定法（CMT）、熒光顯微鏡計數(shù)法等。

3.1 鏡檢計數(shù)法在生鮮乳體細胞檢測中的應(yīng)用

鏡檢計數(shù)法是用生鮮乳定量涂片，然后根據(jù)鏡檢換算其中每毫升乳樣中的體細胞數(shù)量，該方法準(zhǔn)確，設(shè)備要求低，可用于校正分析儀，但該方法較費時，不能作為現(xiàn)場快速和大量樣品時使用[17]。庫爾特計數(shù)儀計數(shù)法可以直接讀出每毫升樣品的生鮮乳體細胞數(shù)，此方法前處理繁瑣且時間長。加利福尼亞細胞數(shù)測定法（CMT）操作簡單，價格相對低廉，能夠現(xiàn)場快速判斷出哪個乳頭患有乳房炎。其測定原理是利用強堿和表面活性劑破壞體細胞膜，細胞破裂后釋放出包含的內(nèi)容物，進而交聯(lián)或者與試劑或者乳成分相互作用生成絮狀沉淀物或者生成凝塊，根據(jù)生成的凝塊或者沉淀的數(shù)量，可以衡量生鮮乳中體細胞數(shù)的范圍。

3.2 熒光顯微鏡計數(shù)法在生鮮乳體細胞檢測中的應(yīng)用

熒光顯微鏡計數(shù)法采用的是熒光染色劑。此法相對標(biāo)準(zhǔn)方法背景較為清晰，但制片、鏡檢過程要占用大量的時間，因此不適合于大量快速的檢測應(yīng)用。

3.3 生鮮乳中菌落總數(shù)的檢測技術(shù)

目前生鮮乳中菌落總數(shù)檢測常用的方法主要有平皿菌落計數(shù)法、Bactoscan FC法、電阻抗法、生物發(fā)光ATP法[18]。

平皿菌落計數(shù)法是常用的活菌計數(shù)法，但該方法測得的結(jié)果小于實際數(shù)值。操作簡單，重復(fù)性好，但是時間較長。Bactoscan FC法是檢測分析生鮮乳的質(zhì)量和組分的一種方法。該方法是針對單個細胞計數(shù)，準(zhǔn)確、快速、耗時短，但是價格昂貴。電阻抗法檢測細菌總數(shù)是根據(jù)微生物的生長代謝將培養(yǎng)基中的碳水化合物轉(zhuǎn)化成氨基酸和乳酸等，根據(jù)儀器記錄培養(yǎng)基的電阻抗波動的DT時間來檢測微生物的數(shù)量，該方法檢測周期短、操作簡便。生物發(fā)光ATP技術(shù)，細胞內(nèi)的ATP含量反映細胞的存活活力，當(dāng)細胞處于受損或死亡狀態(tài)時其ATP含量將下降或消失，生物發(fā)光ATP技術(shù)就是利用ATP生物發(fā)光細胞內(nèi)的ATP值來計算活菌的數(shù)量[19]。

4 結(jié)論與展望

隨著人們對高品質(zhì)生鮮乳及乳制品的需求，快速、高效、準(zhǔn)確的檢測手段在生鮮乳及乳制品生產(chǎn)應(yīng)用中對實現(xiàn)乳業(yè)生產(chǎn)過程的便捷高效的管理以及提高乳制品的質(zhì)量具有重要意義。目前，不斷出現(xiàn)的新檢測技術(shù)因其存在的優(yōu)越性和局限性限制了它們在乳制品行業(yè)中的應(yīng)用。因此，以生鮮乳及乳制品的最終消費者為考慮對象，探索新型的檢測技術(shù)，以便捷、高效、準(zhǔn)確相結(jié)合為特點的檢測技術(shù)將成為未來研究的主要方向。同時，探索先進的檢測技術(shù)也是提高人們生活水平和乳制品行業(yè)競爭力不可缺少的。

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