AG490對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響

付金鵬，宋寶驥，肖元廷

AG490對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響

付金鵬，宋寶驥△，肖元廷

目的 探討AG490對重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠胰腺腺泡細胞凋亡及凋亡基因FasL和Bcl-2表達的影響。方法 健康Wistar大鼠72只，按隨機數(shù)字表法分為對照組（24只）、SAP模型組（24只）和AG490治療組（24只）。后2組采用5%?；悄懰徕c膽胰管內(nèi)逆行注入誘導(dǎo)SAP大鼠模型，3組大鼠均于術(shù)后6 h、12 h、24 h心臟采血，檢測血清淀粉酶。剖腹取胰腺組織，光鏡下觀察胰腺組織病理改變并進行病理學(xué)評分，TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)，RT-PCR檢測胰腺組織FasL、Bcl-2 mRNA的表達。結(jié)果 與對照組比較，SAP模型組大鼠胰腺病理損傷加重，病理評分增高，血清淀粉酶明顯升高，胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)升高，F(xiàn)asL mRNA表達明顯升高，Bcl-2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與SAP模型組相比較，AG490治療組大鼠胰腺病理損傷明顯改善，病理評分降低，血清淀粉酶明顯降低，胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)升高，F(xiàn)asL mRNA表達明顯升高，Bcl-2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)論 抑制JAK/STAT3信號通路可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，增加胰腺腺泡細胞凋亡，從而減輕胰腺炎癥反應(yīng)及病理損害。

胰腺炎；急性??；蛋白酪氨酸激酶類；胰腺；細胞凋亡；基因；配體；基因，bcl-2；AG490；FasL

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是以胰腺彌漫性出血和組織壞死為特征、累及全身多個臟器的危急重癥，病情兇險，病死率高達10%～24%［1］。在胰腺炎發(fā)生發(fā)展過程中伴隨大量炎性介質(zhì)的釋放，這些炎性介質(zhì)可以促進胰腺腺泡細胞凋亡或細胞壞死。JAK/STAT途徑作為重要的炎癥反應(yīng)信號通路，在炎癥反應(yīng)途徑中起重要調(diào)節(jié)作用。早期阻斷JAK/STAT信號通路可在一定程度上緩解SAP炎癥反應(yīng)［2］，但其對胰腺腺泡細胞凋亡的影響鮮有報道。本文旨在通過建立SAP模型，觀察JAK2特異性抑制劑AG490對SAP大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響，從而為臨床治療SAP提供新的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 AG490購自美國Sigma公司，?；悄懰徕c購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，健康Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證編號：SCXK（京）2007-0001］，引物設(shè)計和合成購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，TUNEL法細胞原位凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 動物和模型制備 Ⅰ級Wistar大鼠72只，體質(zhì)量230～300 g，雌雄各半，應(yīng)用隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為對照組（24只）、SAP模型組（24只）和AG490治療組（24只）。后2組采用5%?；悄懰徕c膽胰管內(nèi)逆行注入的方法誘導(dǎo)SAP大鼠模型。大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，AG490治療組于造模前30 min腹部皮下注射8.0 mg/kg AG490。麻醉滿意后固定大鼠，無菌條件下取劍突下0.5～1.0 cm上腹正中切口入腹。對照組開腹后翻動胰腺數(shù)次；SAP模型組和AG490治療組，使用連接微量注射泵的一次性靜脈留置套管針于膽胰管開口處的十二指腸對系膜緣的腸壁進行穿刺，進入腸腔后即將針芯退出，將套管經(jīng)膽胰管開口處逆行插入膽胰管約1.0 cm，以無損傷小動脈夾于肝門部阻斷膽總管后，以0.1 mL/min的速度勻速注入5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）。注畢5 min后拔管，去除小動脈夾，以無水乙醇棉簽處理腸壁穿刺處，回納十二指腸后關(guān)腹。

1.2.2 標本采集和保存 3組大鼠均于術(shù)后6 h、12 h、24 h麻醉后心臟采血，室溫放置1 h待自然凝固后，于4℃3 000 r/min離心10 min獲得血清，凍存于-20℃?zhèn)錅y淀粉酶。取血后剖腹，切取胰尾部組織，液氮保存以備總RNA及蛋白提取。取病變較為一致的胰頭部組織置10%福爾馬林溶液中固定，4 μm連續(xù)切片供HE染色、TUNEL凋亡細胞檢測。

1.2.3 血清淀粉酶測定 采用全自動生化分析儀檢測。

1.2.4 胰腺組織病理學(xué)評分 胰腺組織標本常規(guī)制作病理石蠟切片，HE染色，在光鏡下比較胰腺病理組織學(xué)改變，同時按照鏡下病理評分標準［3］由病理科醫(yī)師進行雙盲評分。

1.2.5 胰腺細胞凋亡檢測 采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法（TUNEL）檢測，操作嚴格按照說明書進行。以雙蒸水代替TDT作陰性對照，DNAase處理的切片作陽性對照，細胞凋亡陽性結(jié)果表現(xiàn)為胞核染成棕褐色，胞核固縮、空泡化，染色質(zhì)濃縮、邊聚，凋亡小體形成。于每張切片中選取10個高倍視野（400倍），分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)× 100%。

1.2.6 RT-PCR檢測胰腺組織中 FasL、Bcl-2 mRNA的表達 Trizol一步法提取胰腺組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA（日本寶生物試劑盒），熒光定量PCR反應(yīng)條件（美國Bio-Rad公司熒光定量PCR儀）：95℃5 min，95℃45 s，57℃45 s，72℃60 s，35個循環(huán)；末循環(huán)72℃10 min。引物序列：FasL上游5′-CCAGGACAAAGGAGACC-3′，下游5′-GGGTTG GCTATTTGCTT-3′，擴增產(chǎn)物長度 275 bp；Bcl-2上游 5′-GGCATCTTCTCCTTCCAG-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTAT-3′，擴增產(chǎn)物長度441 bp；β-actin上游 5′-TGACG GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游5′-CTAGA AGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，擴增產(chǎn)物長度666 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。定量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗分析，均呈正態(tài)分布，其數(shù)值以均數(shù)±標準差（x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清淀粉酶變化 與對照組相比，各時間點SAP模型組血清淀粉酶明顯升高，與SAP模型組相比，AG490治療組各時點的血清淀粉酶明顯降低（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of the serum levels of amylase in three groups表1 3組大鼠血清淀粉酶水平比較（n=24，U/L，x±s）

2.2 3組大鼠胰腺組織病理學(xué)改變及病理評分 對照組各時相胰腺組織正常，伴或不伴間質(zhì)輕度水腫，無出血及炎癥細胞浸潤，見圖1。SAP模型組6 h鏡下見胰腺小葉間充血、水腫，伴有少量的炎癥細胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)完整，伴輕度局限點狀壞死，無出血；12 h見小葉間明顯充血水腫、炎癥細胞浸潤增多，伴有點狀壞死和出血，可見凋亡小體形成；24 h見腺泡張力高、廣泛分隔小葉，小葉正常結(jié)構(gòu)破壞、喪失，實質(zhì)廣泛出血、血管擴張，實質(zhì)小片狀脂肪變性、壞死明顯，大量炎癥細胞浸潤，見圖2。AG490治療組6 h鏡下見間質(zhì)輕度水腫，少量炎癥細胞浸潤；12 h見胰腺小葉間充血、水腫，少量炎癥細胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)尚完整，有局限點狀壞死，無出血；24 h見小葉間明顯充血水腫、炎癥細胞浸潤增多，部分小葉正常結(jié)構(gòu)破壞、喪失，伴有點狀壞死和出血，有凋亡小體形成，見圖3。SAP模型組病理學(xué)評分高于對照組和AG490治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Fig.1 Pancreas image of control group（HE staining，×200）圖1 對照組胰腺（HE染色，×200）

Fig.2 Pancreas image of SAP model group（HE staining，×100）圖2 SAP模型組胰腺（HE染色，×100）

Fig.3 Pancreas image of AG490 treatment group（HE staining，×100）圖3 AG490治療組胰腺（HE染色，×100）

Tab.2 The pathological scores of pancreatic tissues in three groups表2 3組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分 （n=24，x±s）

2.3 3組大鼠胰腺細胞凋亡檢測 SAP模型組胰腺細胞凋亡指數(shù)高于對照組，低于AG490治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 The apoptosis index of pancreatic acinar cells in three groups表3 3組大鼠胰腺細胞凋亡指數(shù)水平（n=24，%，x±s）

2.4 3組大鼠胰腺組織FasL mRNA的表達 SAP模型組胰腺組織FasL mRNA表達高于對照組，低于AG490治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Tab.4 The changes of FasL mRNA expression in pancreatic tissue in three groups表43 組胰腺組織FasL mRNA的表達變化（n=24，x±s）

2.5 3組大鼠胰腺組織Bcl-2 mRNA的表達 SAP模型組胰腺組織Bcl-2 mRNA表達低于對照組，高于AG490治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

Tab.5 The changes of Bcl-2 mRNA expression in pancreatic tissue in three groups表53 組胰腺組織Bcl-2 mRNA的表達變化（n=24，x±s）

3 討論

急性胰腺炎是外科常見急腹癥之一。其發(fā)病機制尚未闡明。既往研究認為，急性胰腺炎時，在損傷因子（如異常激活的胰酶）作用下，單核（巨噬）細胞被激活并釋放多種細胞因子，炎癥反應(yīng)失控，促炎細胞因子大量釋放，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），引起自身細胞和組織損傷，進而損傷多器官功能而致多器官功能不全（MODS），甚至死亡。JAK/STAT途徑作為重要的炎癥反應(yīng)信號通路，在炎癥反應(yīng)途徑中起重要調(diào)節(jié)作用。JAK2和STAT3作為該家族中的重要成員，在細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用［4-5］。目前已發(fā)現(xiàn)多種細胞因子，包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β、核因子（NF）-κB等，它們通過激活JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用［6］。JAK2/STAT3信號通路的激活可誘導(dǎo)IL-6及IL-18過度表達，可能加重SAP時的炎癥反應(yīng)和肺損傷［7］。早期阻斷JAK/STAT信號通路可在一定程度上緩解SAP炎癥反應(yīng)［2］。應(yīng)用JAK2特異性抑制劑AG490抑制該信號通路過度活化，可減少各種促炎因子的產(chǎn)生，從而有效改善胰腺局部及遠處器官損傷［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAP模型組大鼠血清淀粉酶明顯升高，胰腺病理損傷逐漸加重。與SAP模型組相比較，AG490治療組大鼠血清淀粉酶明顯降低，胰腺病理損傷明顯改善。

現(xiàn)有研究表明，在急性胰腺炎起病初期，各類損傷因素損害胰腺腺泡細胞。如果胰腺腺泡細胞死亡以壞死方式為主，則引發(fā)炎癥，繼而觸發(fā)白細胞系統(tǒng)和細胞因子網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)放大反應(yīng)，損傷其他臟器，誘發(fā)多臟器功能衰竭，從而導(dǎo)致重癥胰腺炎的發(fā)生。如果胰腺腺泡細胞死亡以凋亡方式為主，則不會引起嚴重的炎癥反應(yīng)和其他臟器損害，表現(xiàn)為輕型胰腺炎。有學(xué)者研究顯示中藥配方大承氣湯能誘導(dǎo)體外和體內(nèi)急性胰腺炎（AP）模型的腺泡細胞發(fā)生凋亡，并減少細胞壞死，其可能的機制是減少AP時腺泡細胞活性氧的產(chǎn)生并增加一氧化氮水平，使腺泡細胞的死亡方式從壞死向凋亡轉(zhuǎn)換［9］。因此，早期應(yīng)用藥物干預(yù)，誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞凋亡，已成為治療急性胰腺炎的新研究課題。

細胞凋亡是受眾多凋亡相關(guān)基因控制的程序性細胞死亡，其調(diào)控途徑主要有細胞外死亡受體途徑和細胞內(nèi)線粒體途徑。有研究發(fā)現(xiàn)Fas/FasL死亡受體凋亡途徑介導(dǎo)了急性胰腺炎腺泡細胞凋亡，F(xiàn)as基因缺失可明顯加重蛙皮素誘導(dǎo)的鼠急性胰腺炎病情［10］。Bcl-2亞家族對細胞凋亡起抑制作用，其中Bcl-2控制著凋亡的一些共同通路。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAP模型組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)升高，F(xiàn)asL mRNA表達明顯升高，Bcl-2 mRNA表達明顯降低。與SAP模型組相比，AG490治療組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)明顯升高，F(xiàn)asL mRNA表達明顯升高，Bcl-2 mRNA表達明顯降低。由此推測，AG490可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因，增加胰腺腺泡細胞凋亡，從而減輕胰腺炎癥反應(yīng)及病理損害。

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（2014-09-22收稿 2015-01-14修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of AG490 on the apoptosis of pancreatic acinar cells in rat model of severe acute pancreatitis

FU Jinpeng，SONG Baoji△，XIAO Yuanting
Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China
△Corresponding Author E-mail:2802283789@qq.com

Objective To investigate the effect of AG490 on the apoptosis of pancreatic acinar cells and expression of apoptosis gene FasL and Bcl-2 in rat model of severe acute pancreatitis（SAP）.Methods Seventy-two healthy Wistar rats were randomly divided into control group（n=24），SAP group（n=24）and AG490 group（n=24）.Heart blood samples were taken to detect serum amylase at 6 h，12 h and 24 h after operation in three groups.Pancreatic tissue were observed under light microscope to analyze pathological changes and pathological scores.The index of pancreatic acinar cell apoptosis was detected by TUNEL.The expressions of FasL and Bcl-2 mRNA in pancreatic tissue was detected by RT-PCR.Results Compared with control group，the damage of pancreatic tissue was gradually increased，the serum level of amylase significantly increased（P＜0.01），the index of pancreatic acinar cell apoptosis increased，the expression of FasL mRNA was significantly increased，the expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）in SAP group.Compared with SAP group，the pancreatic injury was improved significantly，the serum amylase significantly decreased（P＜0.01），the apoptosis index rate of pancreatic acinar cells was increased，the expression of FasL mRNA was significantly increased，and the expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）in AG490 group.Conclusion The inhibition of the JAK/STAT3 signaling pathway may regulate the apoptosis-related gene to increase the apoptosis of pancreatic acinar cells，thereby reducing the reaction and pathological damages of acute pancreatitis.

pancreatitis；acute disease；protein-tyrosine kinases；pancreas；apoptosis；genes；ligands；genes，bcl-2；AG490；FasL

R657.5+1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.009

天津醫(yī)院普通外科（郵編300211）

△E-mail:2802283789@qq.com