葛根芩連湯對高脂飼料飼喂的大鼠非酒精性脂肪性肝炎的實驗研究

宋紅梅 曲 巖 李紹民▲ 陳景華 張 寧

1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江佳木斯154007

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與代謝相關(guān)的應(yīng)激性肝損傷，主要特征是甘油三酯（TG）蓄積，包括單純性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化（NAFC）。研究表明，NAFLD已成為無癥狀性轉(zhuǎn)氨酶升高的首要原因[1-3]，同時又是肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)組分在肝臟的集中體現(xiàn)，嚴重威脅著人民的身體健康。從NAFL到NAFC的過程中，NASH起著限速的作用，是形成肝硬化的重要原因之一[4-5]。目前研究證實，中醫(yī)藥對NASH的防治具有全方位、多靶點的立體作用，還能針對發(fā)病的脂代謝紊亂、胰島素抵抗[6-7]、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷等多個環(huán)節(jié)的效應(yīng)指標進行有效調(diào)節(jié)?，F(xiàn)代研究表明，葛根芩連湯具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。所以本實驗選用葛根芩連湯干預(yù)高脂飼料誘導(dǎo)的NASH大鼠模型[8]，為開發(fā)防治NASH有效的中藥制劑提供新思路和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周雄性SD大鼠40只，體重約為（150±200）g，由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗中藥 處方飲片均購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店，依《傷寒論》生藥比例為葛根∶黃連∶黃芩∶炙甘草=8∶3∶3∶2，以該劑量作為低劑量，2倍該劑量為高劑量。用藥劑量按實驗動物與60kg成人體表面積比等效量核算比率，計算動物的等效劑量。實驗時以去純化水配制成所需濃度，放冰箱保存。

1.1.3 實驗飼料 基礎(chǔ)飼料及高脂飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）。

1.1.4 試劑 AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C的全自動生化分析試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；IL-6、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.5 主要儀器 7160全自動生化儀（日本日立公司），美國MULTISKAN MK3全自動酶標儀（Thermo），CH-6010組織勻漿機（KINEMATTICA）。其他設(shè)備及器具包括：手術(shù)器械、離心管、移液管、吸管、試管、燒杯等。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 以高脂飼料連續(xù)飼喂8周[9]，自由飲水、攝食，建立NASH大鼠模型。

1.2.2 分組及處置 全部SD大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料1周后，隨機分為4組，每組10只，分別為空白組、模型組、葛根芩連湯低劑量組、葛根芩連湯高劑量組?？瞻捉M給予普通飼料，模型組和給藥組給予高脂飼料。給藥組在飼喂高脂詞料的同時分別給予10mL/kg鼠重相應(yīng)濃度中藥灌胃；模型組和空白組按鼠重灌服純化水。每天固定時間進行一次灌胃，每個組的造模和灌胃同行進行，實施8周結(jié)束。

1.2.3 標本采集 實驗8周結(jié)束全部大鼠取材，取大鼠腹主動脈血及肝組織用于血清學(xué)和肝組織相關(guān)指標檢測。

1.2.4 血清學(xué)指標 全自動生化分析儀進行測定血清的相關(guān)指標：ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C。酶聯(lián)免疫法測定血清IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.5 肝組織勻漿上清指標 肝臟IL-6、IL-10、TNF-α水平。在冰水浴中，取肝組織利用超聲勻漿機制成勻漿，靜置一會，離心后取上清液，按試劑盒說明進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件，計量資料以（）表示，對實驗結(jié)果進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟酶學(xué)

在血清ALT、AST水平檢測，模型組顯著高于空白組（P＜0.01），葛根芩連湯高、低劑量組顯著降低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組血清ALT、AST比較（± s，U/L）

表1 各組血清ALT、AST比較（± s，U/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n ALT AST空白組 10 296.75±3.59 18.59±2.23模型組 10 421.95±12.64** 35.68±3.15**葛根芩連湯低劑量組 10 290.15±15.69## 27.68±4.39##葛根芩連湯高劑量組 10 208.36±16.98## 24.59±4.29#

2.2 血脂

與空白組比較，模型組血清HDL-C水平顯著降低，血清LDL-C、TG、TC含量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比增加，血清TG、TC、LDL-C水平下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比較（± s，mmol/L）

表2 各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比較（± s，mmol/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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表3 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

表3 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n IL-6 IL-10 TNF-α空白組 10 24.63±5.16 190.58±15.21 85.39±30.25模型組 10 130.51±12.68** 36.95±10.12** 228.39±20.03**葛根芩連湯低劑量組 10 165.39±10.11## 110.80±10.06## 80.61±10.04##葛根芩連湯高劑量組 10 61.92±15.08## 240.96±30.11# 100.65±20.09##

表4 各組肝組織IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

表4 各組肝組織IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n IL-6 IL-10 TNF-α空白組 10 144.63±11.16 253.58±11.21 455.39±10.25模型組 10 180.51±11.68** 216.95±12.12** 608.39±40.03**葛根芩連湯低劑量組 10 65.39±10.51## 250.80±12.06## 530.61±18.04##葛根芩連湯高劑量組 10 68.92±5.08# 246.96±15.11## 530.65±40.09##

2.3 血清IL-6、IL-10、TNF-α測定

與空白組比較，模型組血清IL-10顯著降低，血清IL-6、TNF-α明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根芩連湯高、低劑量組在增加血清IL-10、降低血清IL-6、TNF-α方面差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α測定

與空白組相比，模型組肝組織勻漿IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；葛根芩連湯高、低劑量組與模型組相比，對肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α的改善，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對NASH的發(fā)病機制及治療已經(jīng)進行了大量研究，但由于該病發(fā)病的復(fù)雜機制及西藥作用的單一性使研究受到阻礙，而葛根芩連湯治療NASH方面鮮有報道。本實驗采用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型[10-11]，該模型的建立符合人類NASH常見的發(fā)病因素，與人類NASH的發(fā)病機制也基本相似，能出現(xiàn)以胰島素抵抗、代謝綜合征等為特征的全身代謝紊亂表現(xiàn)，肝臟組織病變具有進行性發(fā)展的特點。根據(jù)配方的不同，多數(shù)可以在4～8周內(nèi)形成病變程度逐漸加重的NASH模型[12]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯可用于治療2型糖尿病濕熱內(nèi)蘊證，饋蕩性結(jié)腸炎等疾病[13-15]，具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。因此，本實驗遵循中醫(yī)學(xué)“異病同治”的原則[16]選用葛根芩連湯進行防治NASH的探索性研究。本實驗結(jié)果顯示，在肝細胞損害方面，造模8周后，大鼠模型血清ALT、AST水平顯著升高，葛根芩連湯同時干預(yù)的各組，血清ALT、AST水平較模型組明顯降低，提示葛根芩連湯高、低劑量組同時干預(yù)對防治NASH轉(zhuǎn)氨酶升高方面有積極作用；在血脂代謝方面，造模8周后，大鼠模型血清LDL-C、TG、TC含量顯著升高，HDL-C顯著降低，葛根芩湯同時干預(yù)的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比明顯增加，血清TG、TC、LDL-C水平明顯下降，提示葛根芩連湯基本可以達到對NASH脂代謝異常的改善作用[17-19]；在血清及肝組織炎性因子方面，造模8周后，大鼠模型血清及肝組織IL-6、TNF-α含量顯著升高，IL-10顯著降低。與模型組相比，葛根芩連湯同時干預(yù)的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組在增加IL-10、降低IL-6、TNF-α方面均差異顯著。提示葛根芩連湯在改善炎性因子方面，不僅對NASH引起的肝臟局部炎癥有影響，同時能夠改善全身血清炎癥因子水平，并從抑制促炎因子，提高抑炎因子兩方面動態(tài)調(diào)控炎癥的發(fā)展。雖然中醫(yī)藥防治NASH的實驗研究為臨床用藥及新藥開發(fā)提供了更多的實驗數(shù)據(jù)，可以看到中醫(yī)藥多靶點調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的優(yōu)勢，特別是在調(diào)節(jié)脂代謝、干細胞損傷、炎癥等方面效果顯著。然而，其中仍然存在一些問題：目前實驗研究所用的動物模型雖然力求在病因、發(fā)病機制、組織病理學(xué)表現(xiàn)上與人類接近，但仍不能完全符合中醫(yī)傳統(tǒng)的證候?qū)W特點，對于中醫(yī)藥的實驗研究，仍缺乏病證結(jié)合的理想模型，極大影響了中醫(yī)藥防治NASH的研究進展。而且對于實驗研究結(jié)果缺少細致地思考與分析，普遍停留在重復(fù)性認識上，研究結(jié)果回歸臨床的價值少有體現(xiàn)。所以今后的研究應(yīng)盡可能緊密聯(lián)系臨床實際，對研究結(jié)果進行深入地思考分析，必要時可進行重復(fù)實驗以驗證研究結(jié)果的可靠性，從而為臨床治療提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

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