玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工藝優(yōu)化

左瑩，張萍，曹雪丹，張惠，張新華

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，寧夏銀川750021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，浙江臺州318020；3.新疆阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆阿克蘇843000）

玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工藝優(yōu)化

左瑩1，張萍1，曹雪丹2，張惠1，張新華3

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，寧夏銀川750021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，浙江臺州318020；3.新疆阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆阿克蘇843000）

以玉米淀粉糖渣為研究對象，采用酶法水解糖渣中的蛋白，并優(yōu)化酶催化法提取蛋白的工藝條件，結(jié)果表明：糖渣中蛋白含量最高33.1 g/100 g，尤其是谷氨酸、亮氨酸等呈味氨基酸含量較高，符合開發(fā)成為調(diào)味品或食品添加劑的基本要求；通過不同酶品種水解糖渣進(jìn)行蛋白提取，結(jié)果表明，堿性蛋白酶提取率最高29.02%；采用單因素結(jié)果分析結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化糖渣中蛋白分離工藝，結(jié)果為提取溫度45℃，pH11.5，加酶量1%，料液比1∶11（體積比），提取時(shí)間為3 h時(shí)提取率可達(dá)39.77%；對所提蛋白中氨基酸組分分析可知谷氨酸、亮氨酸含量較糖渣中含量增加最多，分別可達(dá)8.332和6.089，具有開發(fā)利用的價(jià)值和潛力。

玉米淀粉糖渣；酶法；提取蛋白

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉在制糖工業(yè)或發(fā)酵企業(yè)制糖工段經(jīng)雙酶法制糖后過濾糖液得到的濾渣，產(chǎn)量很大，具不無完全統(tǒng)計(jì)每年僅發(fā)酵企業(yè)就產(chǎn)生高達(dá)1 500 t玉米淀粉糖渣。隨著以玉米淀粉為原料的發(fā)酵及制糖企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，糖渣副產(chǎn)物亦隨之增多，使企業(yè)的環(huán)保壓力越來越大；若簡單熱風(fēng)干燥以飼料出售，能耗高、產(chǎn)品附加值低。然而對玉米淀粉糖渣理化分析發(fā)現(xiàn)其蛋白含量較豐富，達(dá)到30%以上。且有文獻(xiàn)報(bào)道，來源于玉米淀粉糖渣的蛋白更是不含重金屬等毒性物質(zhì)、富含脂類、糖類等成分，含有大量呈味氨基酸、具有良好的消化性和高營養(yǎng)價(jià)值。具有開發(fā)成調(diào)味品、食品添加劑、功能性蛋白質(zhì)粉、膳食蛋白添加劑的潛力[1-2]。本課題擬采用酶法催化玉米淀粉糖渣水解，確定最適酶的品種，并優(yōu)化催化玉米淀粉糖渣中蛋白分離的催化條件，以提高蛋白提取率，并對分離蛋白中氨基酸成分進(jìn)行分析，功能特性進(jìn)行評定，將為探索玉米淀粉糖渣的深加工、解決企業(yè)廢料環(huán)境污染問題，延長產(chǎn)業(yè)鏈等提供前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉制糖后糖渣：伊品生物技術(shù)有限公司；酸性蛋白酶（30 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、堿性蛋白酶（100 000 U/g）：夏盛實(shí)業(yè)有限公司；Folin-酚法所用試劑、苯酚硫酸法等所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HH—2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋-雙孔：杭州拓興實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-2酸度計(jì)：上海精科儀器廠；MGLG20-W臺式高速離心機(jī)：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；RT-12高速粉碎機(jī)：北京普諾眾達(dá)科技有限公司；752Pro紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日立高新技術(shù)公司；E02140型電子分析天平：梅特勒—托利多儀器上海有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 感官及理化成份分析

粗蛋白含量的測定按GB/T5009.5-2010《食品中粗蛋白含量的測定》[3]；粗脂肪含量的測定按索氏抽提法GB/T14772-2008《食品中粗脂肪含量的測定》[4]；水分含量的測定按直接干燥法GB/T5009.3-2010《食品中水分的測定》[5]；灰分含量的測定按直接灰化法GB/ T5009.4-2010《食品中灰分的測定》[6]。

1.3.2 蛋白提取工藝

參考陳中愛[2]的方法，準(zhǔn)確稱量15.0 g糖渣，加去離子水適量，調(diào)節(jié)pH，加酶液，在既定的溫度下攪拌進(jìn)行反應(yīng)，水解完畢后在80℃下滅酶15 min，然后離心分離，取上清液測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 酶品種篩選試驗(yàn)

參考陳中愛[2]的方法，以提取率為指標(biāo)進(jìn)行篩選，從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶中選出提取蛋白效果最好的一種，這3種酶均在各自的最適條件對糖渣進(jìn)行水解。

1.4 單因素對酶催化蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化

有文獻(xiàn)[2]顯示，加酶催化時(shí)的溫度、pH、加酶量、提取時(shí)間和料液比（體積比）等催化條件都會對催化效果產(chǎn)生顯著影響，參考陳中愛[2]等的方法，對堿性蛋白酶進(jìn)行以上因素的單因素試驗(yàn)，確定單因素試驗(yàn)的最優(yōu)催化條件。

1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化蛋白酶催化條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)提取率為主要參考指標(biāo)，設(shè)計(jì)五因素四水平的試驗(yàn)如表1。

表1 蛋白酶催化條件正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1Orthogonal factor level design of protease catalyticconditions

擬確定各因素對蛋白提取率的顯著性，并在此基礎(chǔ)上確定各因素的最佳組合條件。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

1.6 酶處理前后氨基酸組分分析

對于玉米淀粉糖渣干粉與經(jīng)酶處理后的玉米淀粉糖渣中氨基酸的組分采用氨基酸分析儀測定氨基酸含量[7]，并對酶處理前后各氨基酸組分變化進(jìn)行比對分析。

1.7 蛋白含量的測定

參考陳中愛[2]的方法，采用Folin-酚法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)固體：采用凱氏定氮法。

1.8 蛋白提取率計(jì)算

粗蛋白提取率（%）=提取蛋白粗品的克數(shù)/干渣樣品中蛋白的克數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 感官與理化分析

玉米制糖脫糖后糖渣感官分析結(jié)果如表2，濕渣呈淡黃色團(tuán)塊狀氣味微酸，干渣顏色略深（分析與熱干燥有關(guān)），呈棕黃色，無明顯氣味。對糖渣的理化成分結(jié)果如表3，渣中蛋白含量33.1 g/100 g（占干物質(zhì)33.1%），此外還有23.7%的糖類物質(zhì)和少量的脂肪（9.74 g/100 g）、灰分（4.79 g/100 g）等。糖渣中蛋白質(zhì)含量較高，有文獻(xiàn)顯示其中的重金屬含量也遠(yuǎn)在國家食品標(biāo)準(zhǔn)的限度以下[8]，具有開發(fā)成為食品添加劑或功能性食品的前提條件。

表2 玉米淀粉糖渣感官分析Table 2Sensory analysis of corn starch sugar residue

表3 玉米淀粉糖渣理化指標(biāo)檢測Table 3Physical and chemical indicators to detect of corn starch sugar residueg/100 g

2.2 酶品種的篩選

酶品種的篩選見表4。

表4 催化玉米淀粉糖渣蛋白質(zhì)水解的酶品種的篩選Table 4Catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residueprotein enzyme screening varieties

本試驗(yàn)中選選取中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶對粉碎后的玉米淀粉干渣進(jìn)行蛋白的酶解催化提取。由于不同種類的蛋白酶的作用于蛋白質(zhì)的機(jī)理和酶催化動力學(xué)特征不同導(dǎo)致提取效果有明顯不同。由表4結(jié)果可知，堿性蛋白酶的提取效果在所選3種酶制劑中最好，提取率達(dá)33.14%，有文獻(xiàn)顯示糖渣蛋白主要是堿溶性的谷蛋白，稀堿可以使渣中淀粉結(jié)構(gòu)變得松散，對蛋白質(zhì)和淀粉的分離起到了促進(jìn)作用[9]，同時(shí)堿性蛋白酶是一種內(nèi)切肽酶，能夠水解多種蛋白，提取率相對較高，且售價(jià)合理。所以，本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

在料液比1∶9、提取時(shí)間4 h、酶量1.00%、pH 11的條件下，分別選取35、40、45、50、55、60℃作為試驗(yàn)溫度，測定蛋白提取率，結(jié)果如圖1

圖1 溫度對蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of temperature on the extraction rate of protein

由圖1可知，在溫度為45℃下，蛋白質(zhì)提取率最高，當(dāng)溫度超過45℃時(shí)，隨著溫度的升高提取率有所下降，原因可能是溫度過高，酶蛋白質(zhì)在長時(shí)間受熱的影響下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其是具有催化活性的四級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，易變性，同時(shí)由于疏水基團(tuán)的暴露和展開、蛋白質(zhì)分子的聚集，使糖渣中的蛋白質(zhì)溶解度下降，導(dǎo)致酶提時(shí)蛋白質(zhì)提取率下降[2]。

2.3.2 加酶量對蛋白質(zhì)提取率的影響

在料液比1∶9、提取時(shí)間4 h、提取溫度45℃、pH11的條件下，分別選取酶量0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%、4.0%作為試驗(yàn)條件，測定蛋白提取率。如圖2所示。

圖2 加酶量對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of protein

在加酶量為0.20%～1.00%的范圍內(nèi)，蛋白提取率隨著酶用量的增加而增大。當(dāng)酶的添加量為1.00%時(shí)，蛋白提取率最高，繼續(xù)增大酶量，提取率下降。隨著酶用量的繼續(xù)增加，糖渣蛋白的得率逐漸減少，可能是剛開始加入酶的時(shí)候，底物與酶的活性部位迅速結(jié)合轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物已飽和，酶濃度過高會使部分蛋白質(zhì)水解，綜合提蛋白效果和經(jīng)濟(jì)成本，酶量確定為1.00%。

2.3.3 pH對蛋白質(zhì)提取率的影響

在提取時(shí)間4 h、提取溫度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9條件下，分別選取pH為9、9.5、10、10.5、11、11.5、12作為試驗(yàn)條件，測定蛋白提取率。糖渣蛋白80%以上是堿溶性谷蛋白，因此選擇的試驗(yàn)pH條件都是在堿性條件下。從圖3可以看出隨著pH的增大，提取率呈增大的趨勢，pH為11.0時(shí)，糖渣蛋白提取率達(dá)到33.17%。

圖3 pH對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on the extraction rate of protein

一般情況下，蛋白在胚乳中與淀粉結(jié)合較緊密，難以溶出，堿性環(huán)境能使它們的緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，促使蛋白與淀粉的分離。但是當(dāng)pH過高，如增加到11以上時(shí)，大米蛋白的提取率反而有些下降，這是由于淀粉在堿性條件下糊化后黏度增大，阻礙了蛋白質(zhì)的溶出[10]。因此確定提取糖渣蛋白的pH為11.0。

2.3.4 糖渣料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

在提取時(shí)間4 h、提取溫度45℃、酶量1.00%、pH為11條件下，分別選取料液比為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15作為試驗(yàn)條件，測定蛋白提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 糖渣料液比對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of sugar residue liquid ratio on the extraction rate of protein

從圖4可以看出隨著料液比比例的減少，提取率呈增大的趨勢，當(dāng)達(dá)到1∶11時(shí)達(dá)到最高，糖渣蛋白提取率達(dá)到28.8%，之后進(jìn)一步減小料液比，提取率略有下降，綜合考慮提取率和節(jié)能減排等因素，確定料液比1∶11為最適料液比。

2.3.5 催化時(shí)間對蛋白提取率的影響

在提取溫度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9、pH 11的條件下，分別選取時(shí)間為1、2、3、4、5、6h作為試驗(yàn)條件，測定蛋白提取率。結(jié)果見圖5。

圖5 催化時(shí)間對蛋白提取率的影響Fig.5

由圖5可知，在提取初期，蛋白質(zhì)提取率隨著提取時(shí)間的延長而升高，提取時(shí)間在4 h時(shí)提取率最大；之后，提取率逐漸下降。這可能與部分溶出蛋白質(zhì)可與殘留淀粉重新結(jié)合，使提取率下降有關(guān)，也有文獻(xiàn)顯示蛋白酶催化玉米蛋白質(zhì)水解時(shí)或作用于氨基肽鍵，或作用于羧基肽鍵，也會分解掉部分氨基酸導(dǎo)致其提取率下降[9]。因此確定最佳提取時(shí)間t為4 h。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表5，方差分析如表6。

表5 蛋白酶催化條件正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Table 5Results of orthogonal test of catalytic conditions ofprotease and visual analysis

表6 蛋白酶催化條件正交試驗(yàn)方差分析Table 6Analysis of variance of orthogonal test of protease catalytic conditions

由表5和表6可知，影響蛋白酶催化條件的主次因素依次為pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（C），對各因素不同水平均值進(jìn)行比較，以A4B2C2D1E3組合為最佳條件，即在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取時(shí)間3小時(shí)和提取溫度45℃條件下為正交分析最優(yōu)化條件，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。其中pH、加酶量、料液比對提取率有顯著影響（a=0.05）。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對正交結(jié)果的試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，即在在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取時(shí)間3小時(shí)和提取溫度45℃條件下再次提取玉米淀粉糖渣中的蛋白，蛋白提取率達(dá)33.77%。

2.6 酶解法處理前后氨基酸組分分析

采用氨基酸分析儀分別測定糖渣和經(jīng)堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶分別催化后的樣品中氨基酸組分的含量，結(jié)果如表7所示，堿性蛋白酶處理樣品中氨基酸組分的增長量最大，總氨酸達(dá)42.045 4，其次是中性蛋白酶處理的樣品，而酸性蛋白酶的結(jié)果有所減少，分析原因，可能與玉米蛋白中的氨基酸多為

堿溶性蛋白有關(guān)，且其中的谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的增幅最大，谷氨酸是提鮮的呈味氨基酸，天冬氨酸具有保護(hù)心肌和降低血壓的醫(yī)療作用，而亮氨酸也是常用的營養(yǎng)增補(bǔ)劑和增味劑[11]，在食品行業(yè)中有廣泛的用途，具有進(jìn)一步加工成食品調(diào)味劑和功能性食品的潛力。

表7 不同酶品種催化玉米淀粉糖渣水解后氨基酸成分分析Table 7Analysis of amino acid composition in different enzymes catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residue

3 結(jié)論與討論

1）玉米淀粉糖渣中富含蛋白質(zhì)、糖類和脂類物質(zhì)，且重金屬含量低于食品限量，具備開發(fā)為功能性蛋白粉、呈味劑或提鮮劑等食品添加劑的前提條件。

2）經(jīng)單因素優(yōu)化試驗(yàn)表明，采用45℃、1%加酶量、pH11和料液比1∶11體積比的提取條件，蛋白質(zhì)提取率最高。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其結(jié)果表明各因素對糖渣蛋白提取率影響程度依次為：pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（C），因此確定最佳提取工藝條件為pH11.5，加酶量1.0%，料液比1∶11，提取時(shí)間3小時(shí)和提取溫度45℃，經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證在最佳工藝條件時(shí)的提取率為33.77%。

3）糖渣蛋白提取工藝的報(bào)道主要集中在堿法，酶法、堿酶或雙酶分步法。堿法提取的是80%的堿溶性谷蛋白，酶法提取的是水溶性蛋白、醇溶蛋白及難溶性蛋白，且抗氧化活性可以得到很好的保持，采用酶法提取反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)的固液比小，提取率不高，純度也較低，但酶法提高了蛋白質(zhì)的溶解性，蛋白經(jīng)部分酶解提高了營養(yǎng)價(jià)值，有利于消化、吸收，而且糖渣蛋白特定肽鏈的降解還可能產(chǎn)生具有多種活性的生物活性肽，具有更高的開發(fā)價(jià)值[11]。

4）正交優(yōu)化堿性蛋白酶的催化條件，可以有效提升玉米淀粉糖渣中谷氨酸、亮氨酸等的含量，對玉米淀粉糖渣的開發(fā)和企業(yè)廢渣的有效利用提供了理論依據(jù)，但提取率還有些低，有文獻(xiàn)報(bào)道采用中性蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法水解大米糖渣，可以提高蛋白質(zhì)的提取率，并使蛋白質(zhì)中多種呈味氨基酸和功能性小肽的含量增加[12]，該方法也是玉米淀粉糖渣今后可以進(jìn)一步研究的方向。

[1]高東寧,曹磊,許贛榮.以玉米淀粉糖渣為原料制備米曲發(fā)酵醬油[J].生物加工過程,2011,5(3)61-65

[2]陳中愛,曾海英,董宏偉酶法提取糖渣蛋白的工藝研究[J]食品科技,2011,6(38):236-241

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.5-2010食品中粗蛋白含量的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T14772-2008食品中粗脂肪含量的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.3-2010食品中水分的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.4-2010食品中灰分的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.5-2010食品中氨基酸的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003

[8]高東寧.玉米淀粉糖渣為原料培養(yǎng)米曲和紅曲及醬油釀造[D].無錫:江南大學(xué),2010

[9]奚海燕,張暉.大米蛋白的提取及改性研究[D].無錫:江南大學(xué), 2008

[10]奚海燕,張暉,姚惠源.堿酶分步法從米粉中提取大米蛋白工藝的研究[J].糧油食品科技,2007,15(6):12-14

[11]吳欣欣,玉米蛋白酶解物抗氧化活性研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2013

[12]李綺麗,吳衛(wèi)國,張喻,等雙酶法水解米渣蛋白工藝研究[J].糧食與油脂,2011(1):19-22

Component Analysis of Corn Starch Cake and Enzymatic Extraction of Protein Optimization Technology

ZUO Ying1，ZHANG Ping1，CAO Xue-dan2，ZHANG Hui1，ZHANG Xin-hua3
（1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Technology of Ningxia Polytechnic，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Institute of Citrus，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Taizhou 318020，Zhejiang，China；3.Aksu Prefecture Agricultural Technology Promotion Center，Aksu 843000，Xinjiang，China）

Using enzymatic hydrolysis of the Corn starch cake in the protein as the research object and optimizing process conditions of the enzymatic protein extraction，the results showed that the protein content of corn starch cake in the highest 33.1 g/100 g，especially glutamic acid and leucine amino acid content was higher，which conform to basic requirements of being developed into a seasoning or food additives；proteins were extracted by different enzymes hydrolysis corn stach cake.The results showed that the highest extraction rate of 29.02%alkaline protease；Using single factor analysis combined with the optimization of separation technology of protein sugar dregs in orthogonal experiment；results for the extraction temperature 45℃，pH 11.5，1%of the amount of enzyme，the material liquid ratio 1∶11，extraction time 3 h，extraction rate can reach 39.77%.The protein amino acid composition analysis showed Glutamic acid，leucine content than the sugar content in slag increased most，up to 8.332 and 6.089 respectively，it the value of development and utilization and potential.

corn starch cake；enzymatic；extract protein

2014-07-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.023

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)課題支持項(xiàng)目“催化玉米淀粉糖渣水解的酶品種的篩選研究”（XJ201202）；寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院設(shè)施園藝無土栽培技術(shù)創(chuàng)新中心（培育）項(xiàng)目支持

左瑩（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：植物加工利用。