正交設(shè)計優(yōu)化米糠抗氧化肽的制備工藝

劉梁，孫維礦，趙玲，李赫宇，陳新，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

正交設(shè)計優(yōu)化米糠抗氧化肽的制備工藝

劉梁1，孫維礦1，趙玲1，李赫宇2，陳新1，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

為獲得制備高抗氧化活性米糠肽的生產(chǎn)工藝，分別研究了提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比四個提取工藝單因素參數(shù)對所得米糠肽抗氧化活性的影響，并以超氧陰離子自由基清除率為指標，通過對四個單因素設(shè)計正交試驗優(yōu)化出最佳提取條件為：提取溫度為50℃，提取時間為3h，乙醇體積分數(shù)為70%，液料比為20（mL∶mg），此工藝所得米糠肽的超氧陰離子自由基清除率為71.56%。

正交優(yōu)化；米糠；抗氧化肽；超氧陰離子自由基

目前用于食品抗氧化劑的大多為一些人工合成化合物，如BHA（叔丁基羥基茴香醚）、BHT（2，6-二叔丁基對甲酚）、TBHQ（叔丁基對苯二酚）、PG（沒食子酸丙酯）[1-2]。但隨著科學家對它們的進一步深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有毒性、致癌性等副作用[3-4]。近些年，功能活性肽因其健康安全等特點已成為食品領(lǐng)域研究熱點，而從植物蛋白中提取活性肽更受人們青睞，其中抗氧化肽是最為熱門的課題之一[5]。目前米糠中抗氧化功能成分的研究主要集中在對單一功能成分的研究，而有研究顯示，米糠中總蛋白提取物的抗氧化活性較單一肽更加顯著[6-7]。因此，研究利用酶法提取米糠肽，以超氧陰離子自由基清除率為指標，以得到抗氧化活性最佳的米糠肽為目的，通過正交優(yōu)化米糠中提取抗氧化肽的工藝，為進一步開發(fā)高活性米糠抗氧化肽提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白（水分9.6%，蛋白質(zhì)70.96%，脂肪2.22%，灰分2.53%）：湖北洪森集團提供，堿性蛋白酶（酶活6 000 U/mg）、酸性蛋白酶（酶活6 000 U/mg）、中性蛋白酶（酶活6 000 U/mg）：合肥博美生物科技有限責任公司；復(fù)合蛋白酶（Protamex）、風味酶（Flavourzyme）：Novo Nordisk公司（北京分公司）；三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、鹽酸、三氯乙酸和三氯化鐵均為分析純：天津市大茂化學試劑。

1.2 儀器和設(shè)備

PHS-2C型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機：上海醫(yī)用分析儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)公司；電熱恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；752N型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Waters 600液相色譜，Waters公司；AL204-01電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備米糠提取液工藝流程

米糠提取液提取工藝：稱取2.5 kg米糠，按一定的體積分數(shù)的乙醇，在30℃提取10 h，得到醇提物濃縮液在6 000 r/min離心20 min，得到上清液，上清液用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH進行等電點測定，利用紫外監(jiān)測蛋白濃度，確定pH至4.5，靜置沉淀，6 000 r/min離心20 min，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到米糠蛋白→得到的米糠蛋白→攪拌調(diào)適當?shù)膒H（依據(jù)各酶而定）→加酶→反應(yīng)一定時間（期間加HCl、NaOH維持pH在±0.05范圍內(nèi)）→離心（6000r/min、20min）→滅酶（T=95℃，10 min）→離心（3 000 r/min、20 min）→取上清液定容。1.3.2超氧陰離子自由基清除能力測定方法

Tris-HCl緩沖液2.8mL，pH為8.2，濃度為50 mmol/L中加入0.1 mL蒸餾水，于25℃保溫10 min，然后加入25℃預(yù)溫的60 mmol/L的連苯三酚0.1 mL（空白管樣品用0.1 mL，10 mmol/L的鹽酸代替，測樣品用0.1 mL，50mmol/L提取液代替），體積為3.0mL，在420nm處，測得總吸光度為A1，樣品吸光度A2，空白對照吸光度A3。

O2-清除率/%=A1-（A2-A3）/A1×100%

1.3.3 米糠提取液提取單因素試驗

選取提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比四個因素進行測定。

1.3.4 米糠提取液提取正交試驗

分析上述單因素試驗數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素試驗得出的各因素最適范圍，對提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比四個因素設(shè)計正交試驗，以超氧自由基清除率為指標確定最佳提取條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠提取液提取單因素試驗

提取溫度對米糠提取物抗氧化活性影響：本試驗提取溫度分別選擇為35、40、45、50、55、60℃，在提取時間120 min，在鹽酸濃度為2 mol/L，液料比為1 mL∶mg，計算米糠提取物超氧自由基清除率。米糠蛋白在不同溫度、提取時間下提取后的超氧自由基清除能力變化如圖1所示。

圖1 提取溫度（A）、時間（B）對米糠提取物抗氧化活性影響Fig.1 The influence of temperature（A）and time（B）on theantioxidant activity of the extracts from rice bran

由圖1（A）可以看出，隨著提取溫度的升高，米糠活性肽抗氧化效果逐漸增強，當溫度升至50℃時，米糠多肽有效活性成分對超氧自由基的清除效果都達到最強。一定溫度變化范圍里，溫度上升加快了反應(yīng)速度，使超氧自由基的清除效果增強，在50℃達到最大，增大溫度，超氧自由基的清除效果明顯降低。故選擇最佳提取溫度為50℃。

提取時間對米糠提取物抗氧化活性影響：本試驗提取時間分別選擇為3、4、5、6、7、8 h，鹽酸濃度為2 mol/L，液料比為1 mL∶mg，提取溫度為50℃，計算米糠提取物超氧自由基清除率。不同提取時間下的超氧自由基清除能力變化如圖1（B）所示。

由圖1（B）可以看出，隨著提取時間的增加，米糠提取物超氧自由基清除率微慢上升后趨于平緩。由此得出：提取時間對米糠提取物超氧自由基清除率效果的影響很小。為了節(jié)約成本，選擇提取時間4 h最佳。

乙醇體積分數(shù)對米糠提取物抗氧化活性影響：本試驗乙醇體積分數(shù)分別選擇為50%、60%、70%、80%、90%、100%，提取時間120 min，鹽酸濃度為2 mol/L，液料比為1 mL∶mg，提取溫度為50℃，計算米糠提取物超氧自由基清除率。在不同乙醇體積分數(shù)、液料比下的超氧自由基清除能力變化如圖2所示。

由圖2（A）可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，米糠提取物超氧自由基清除率微慢上升后達到80%后降低。由此得出，選擇乙醇體積分數(shù)為70%最佳。

液料比對米糠提取物抗氧化活性影響：分別選擇為5、10、15、20、25、30 mL∶mg，乙醇體積分數(shù)為70%，在鹽酸濃度為2 mol/L，提取溫度為50℃，提取4 h，米糠提取物超氧自由基清除率隨液料比的變化見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）對米糠提取物抗氧化活性影響Fig.2 The influence of alcohol pecent（A）and solid-liquid ratio（B）on the antioxidant activity of the extracts from rice bran

由圖2（B）可以看出，隨著液料比的增加，米糠提取物超氧自由基清除率緩慢上升后趨于平緩。由此得出：液料比對米糠提取物超氧自由基清除率效果的影響很小。為了節(jié)約成本，選擇液料比10∶1（mL∶mg）最佳。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計方案。選定影響米糠提取物超氧自由基清除率效果顯著的四個因素：A-提取溫度（℃），B-提取時間（h），C-乙醇體積分數(shù)（%），D-液料比（mL∶mg）為參考因素，以米糠提取物超氧自由基清除率為指標，優(yōu)化米糠提取物超氧自由基清除的最佳工藝路線，確定最佳提取工藝條件，實驗結(jié)果見表1。

表1 正交因素與水平Table 1The factors and levels of orthogonal

正交試驗直觀的分析結(jié)果，由此可以判斷出各因素對考察指標的影響大小。極差越大，該因素水平的變化對指標的影響也越大，由正交試驗結(jié)果中極差分析得到：各因素對提取效果主次順序為C>A>D>B。從正交試驗結(jié)果可以看出，四因素的最佳值應(yīng)為：A2B1C2D3。即在以上最佳條件下做了三次驗證實驗，米糠提取物超氧自由基清除率分別為71.56%、71.10%、70.68%，3次提取液中的米糠提取物超氧自由基清除率均無顯著性差異，說明此條件為理想的米糠提取物超氧自由基清除條件。

表2 正交試驗結(jié)果極差分析表Table 2The range analysis of orthogonal test results

乙醇體積分數(shù)和提取溫度兩因素對米糠提取物超氧自由基清除率有顯著性影響，提取時間和液料比對提取的影響次之，其影響順序為：乙醇體積分數(shù)>提取溫度>提取液料比>提取時間。

根據(jù)得到的實驗指標平均值K1、K2、K3繪制米糠提取物超氧自由基清除，平均值與因素水平的關(guān)系圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3 米糠提取物超氧自由基清除率的曲線效應(yīng)圖Fig.3 The effect of rice bran extract on the scavenging rate to superoxide radical

由米糠提取物超氧自由基清除率的曲線效應(yīng)圖可知，在一定范同內(nèi)隨著乙醇體積分數(shù)的提高米糠提取物超氧自由基清除率隨之增高，說明一定濃度范圍內(nèi)乙醇體積分數(shù)提高對米糠提取物超氧自由基清除率有利；提取時間對米糠提取物超氧自由基清除率的影響最小。分析圖正交試驗曲線效應(yīng)可知米糠提取物超氧自由基清除率的最優(yōu)條件是最佳提取（mL∶mg）條件為：A-提取溫度為50（℃），B-提取時間為3（h），C乙醇體積分數(shù)為70（%），D-液料比為20（mL∶mg）

表3 正交試驗方差分析表Table 3The variance analysis of orthogonal test

表3方差分析結(jié)果表明，乙醇體積分數(shù)對米糠提取物超氧自由基清除率效果有顯著性影響。其次，提取溫度是影響提取重要的因素；提取工藝條件可看出，提取條件溫和，米糠提取物超氧自由基清除率高，適于工業(yè)上米糠提取物生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本試驗優(yōu)化米糠提取液提取工藝，根據(jù)單因素試驗得出的各因素最適范圍，對提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比四個因素設(shè)計正交試驗，以超氧自由基清除率為指標確定最佳提取條件。分析正交試驗結(jié)果，米糠提取物超氧自由基清除率的最優(yōu)條件是最佳提取條件為：A-提取溫度為50℃，B-提取時間為3 h，C乙醇體積分數(shù)為70%，D-液料比為20（mL∶mg），此時，米糠提取物超氧自由基清除率分別為71.56%。

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Study on the Extraction of Antioxidant Peptide from Rice Bran by Orthogonal Experiments

LIU Liang1，SUN Wei-kuang1，ZHAO Ling1，LI He-yu2，CHEN Xin1，*
（1.School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

In order to obtain the proper process for preparing high antioxidant rice bran peptide，the influence of extraction temperature，extraction time，ethanol concentration，the ratio of liquid and material on the antioxidant activity of rice bran peptide were studied by orthogonal experiments.The results determined the best extraction approach，and the parameters were extraction temperature 50℃，extraction time 3 h，ethanol concentration 70%，liquid material ratio 20（mL∶mg）.Superoxide radical scavenging rate of rice bran peptide was 71.56%at the above condition.

orthogonal design；rice bran；antioxidant peptide；superoxide radical

2014-12-03

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.024

劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品功能因子研究。

*通信作者：陳新（1978—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品活性物質(zhì)研究與開發(fā)。