南極紅色素與3種天然色素還原性和抗氧化性對比研究

趙倩，王能飛，張梅，金濱濱，吳佐浩，臧家業(yè)，*

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地四川成都611137；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

南極紅色素與3種天然色素還原性和抗氧化性對比研究

趙倩1，王能飛2，張梅1，金濱濱1，吳佐浩2，臧家業(yè)2，*

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地四川成都611137；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

探討南極紅色素、胭脂蟲紅色素、紫甘藍色素、紫蘇色素的還原性和抗氧化性。結果表明，4種天然色素都具有一定程度的還原性和抗氧化性。濃度為1 mg/mL時，超氧陰離子清除率分別為26.52%、20.51%、15.32%、30.65%；DPPH自由基清除率分別為73.11%、16.23%、94.64%、96.92%；羥基自由基清除率分別為67.31%、42.03%、72.67%、58.37%。具有還原性和抗氧化性的天然色素，特別是真菌色素南極紅色素，會有廣闊的應用前景。

天然色素；南極紅色素；還原性；抗氧化性

鑒于合成色素的危害性，特別是其致癌作用[1]，消費者對使用合成色素的食品抵觸心理日益高漲。人們更傾向選擇那些使用天然色素的食品，因為天然色素本身就來源于可食用資源，不僅沒有毒性，有的還有一定的營養(yǎng)價值，甚至有的還有一定的保健功能。例如，類胡蘿卜素有抗癌作用和提高機體免疫能力[2]；黃酮類化合物有抗氧化、抗衰老等作用[3]。因此天然色素越來越受食品加工廠商的青睞。

胭脂蟲紅色素（也稱洋紅酸）是一種提取自雌性胭脂蟲的紅色色素，也是一種品質優(yōu)良的純天然、無毒副作用的動物色素。但是，由于其原料胭脂蟲的飼養(yǎng)受到食物、季節(jié)、天氣、溫度的影響較大，國內(nèi)還沒有胭脂蟲和胭脂蟲紅的生產(chǎn)，胭脂蟲紅色素一直依賴進口，產(chǎn)品供不應求[4]。紫蘇色素和紫甘藍色素分別是提取自紫蘇和紫甘藍的一種紫紅色色素，均可用于腌菜、果汁、飲料、糖漿等著色。Ilhami Gulcin[5]等研究了紫蘇提取物的抗氧化能力和清除自由基能力。張會象[6]研究發(fā)現(xiàn)紫甘藍色素具有一定的抑菌性和抗氧化性。本實驗室自南極土壤樣品中分離純化得到一株產(chǎn)色素真菌Geomyces WNF-15A，通過菌落特征、顯微形態(tài)觀察和ITS序列分析，將其歸為地絲霉屬（Geomyces）[7]。前期研究表明，真菌Geomyces WNF-15A所產(chǎn)色素（取名南極紅色素）為一種紅色粉末，最佳吸收波長為531 nm，色價可達到140，另外，在穩(wěn)定性方面不遜于以廣泛使用的胭脂蟲紅色素。

本試驗研究了南極紅色素、胭脂蟲紅色素、紫甘藍色素、紫蘇色素的還原性和抗氧化性，并對以上性能與VC進行了對比，旨在評價4種色素的生理活性功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

紫甘藍色素、紫蘇色素：購于青島鵬遠天然色素研究所；胭脂蟲紅色素：購于成都格雷西亞化學試劑有限公司；南極紅色素：實驗室自制；VC：購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 試劑

鄰苯三酚，Tris（三羥甲基氨基甲烷）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基），無水乙醇；水楊酸，硫酸亞鐵，過氧化氫；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，六氰合鐵酸鉀，三氯化鐵，三氯乙酸。以上試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

HZQ－F160A全溫搖床：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；通用型冷凍離心機：德國sigma公司；GI54DS自動高壓蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計：島津公司；德國CHRIST Alpha 1-2凍干機：上?；鶇R生物科技有限公司、AL-104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 南極紅色素的制備

用無菌水洗刮Geomyces WNF-15A單菌落，轉入馬鈴薯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d～4 d，作為真菌種子液。將真菌種子液接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵，轉速125 r/min，12℃培養(yǎng)10 d。將發(fā)酵液以7 000 r/min離心20 min，上清液4層紗布過濾。濾液用HPD-722型大孔吸附樹脂浸泡，靜置24 h。將大孔樹脂裝柱，用去離子水洗至洗脫液為無色，改用95%乙醇洗脫至無色，再用去離子水洗至無醇味，收集洗脫液。將洗脫液濃縮，冷凍干燥處理，得到南極紅色素粗粉。

1.3 方法

1.3.1 清除超氧陰離子自由基能力的測定[8]

取不同濃度的南極紅色素樣品溶液0.1 mL，加入3 mL pH=8.2 Tris-HCl緩沖液，25℃環(huán)境保溫20 min，加入0.3 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚，準確反應4min后加入1 mL 10 mol/L HCl終止反應。蒸餾水調零，測定吸光值A420，按下式計算清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度，以蒸餾水代替樣品液；A1為樣品組吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替反應試劑。

紫甘藍色素、紫蘇色素、胭脂蟲紅色素、VC清除超氧陰離子自由基能力的測定方法同前。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的測定[9]

取不同濃度的南極紅色素樣品溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L DPPH無水乙醇溶液2 mL，用無水乙醇補足反應總體積4 mL，混勻，40℃恒溫避光靜置30 min。無水乙醇調零，測定吸光值A517，按下式計算清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度，以蒸餾水代替樣品液；A1為樣品組吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替反應試劑。

紫甘藍色素、紫蘇色素、胭脂蟲紅色素、VC清除DPPH自由基能力的測定方法同前。

1.3.3 清除羥基自由基能力的測定[10]

取不同濃度的南極紅色素樣品溶液2 mL，加入9 mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，混勻，加入8.8 mmol/L H2O2啟動反應，室溫下反應1 h。蒸餾水調零，測定吸光值A510，按下式計算清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度，以蒸餾水代替樣品液；A1為樣品組吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替反應試劑。

紫甘藍色素、紫蘇色素、胭脂蟲紅色素、VC清除羥基自由基能力的測定方法同前。

1.3.4 還原能力的測定[11]

取不同濃度的南極紅色素樣品溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5mL，混勻，混合液50℃水浴20min，快速冷卻，加入2.5mL10%的三氯乙酸溶液，混勻后以3000r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的FeCl3，混勻，反應10 min。蒸餾水調零，測定吸光值A700。

紫甘藍色素、紫蘇色素、胭脂蟲紅色素、VC還原能力的測定方法同前。

2 結果與分析

2.1 清除超氧陰離子自由基能力的測定

自然條件下人體內(nèi)存在一定數(shù)量的超氧陰離子自由基，在不發(fā)生化學變化的條件下對人體無害，但與羥基結合后的產(chǎn)物會導致細胞DNA損壞，破壞人類機體功能。因此，清除自由基能力是考察抗氧化劑的一個重要參考。清除超氧陰離子自由基能力如圖1所示。

圖14 種色素清除超氧陰離子自由基能力的比較Fig.1 The comparison of inhibitory effect of the four pigments on Superoxide anion radicals

由圖1可看出，雖然4種試驗色素清除超氧陰離子自由基的能力都隨色素濃度的增大而增加，但4種色素清除超氧陰離子自由基能力還是有較大的差距。由圖知，清除能力VC>紫蘇色素>南極紅色素>胭脂蟲紅色素>紫甘藍色素。

2.2 清除DPPH自由基能力的測定

DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使吸收逐漸消失，褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。

清除DPPH自由基能力如圖2所示。

圖24 種色素清除DPPH自由基能力的比較Fig.2 The comparison of DPPH free radical-scavenging activity of the four pigments

由圖2可看出4種試驗色素都具有清除DPPH自由基的能力，并且隨著色素濃度的增大而增加。清除能力大小依次為VC>紫甘藍色素>紫蘇色素>南極紅色素>胭脂蟲紅色素。同等濃度的南極紅色素的清除DPPH自由基能力遠大于胭脂蟲紅色素，是南極紅色素對胭脂蟲紅色素的一個明顯優(yōu)勢。

2.3 清除羥基自由基能力的測定

清除羥基自由基能力測定結果如圖3所示。

圖3 4種色素清除羥基自由基能力的比較Fig.3 The comparison of inhibitory effect of the four pigments on Hydroxyl radicals

由圖3看出VC是一種清除羥基自由基很顯著的物質，在濃度為0.5 g/L時，其清除羥基自由基能力就可以達到90%以上，是同濃度其它色素的2倍，甚至3倍。南極紅色素的清除羥基自由基的能力亦優(yōu)于胭脂蟲紅色素。

2.4 還原能力的測定

還原性測定結果如圖4所示。

圖4 4種色素還原能力的比較Fig.4 The comparison of reducing capacity of the four pigments

由圖4可看出各種色素的還原性都隨濃度的增大而增加，但都小于同等濃度的VC。當色素濃度達到1g/L時，還原性大小依次為VC>紫甘藍色素>紫蘇色素>南極紅色素>胭脂蟲紅色素。在色素濃度低于0.3 g/L時，還原性大小依次為VC>南極紅色素>紫甘藍色素>紫蘇色素>胭脂蟲紅色素。在色素濃度較低時，南極紅色素的還原性優(yōu)勢明顯。

3 討論

通過試驗，發(fā)現(xiàn)4種天然色素都具有一定的還原性及清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力。綜合比較不難看出，紫甘藍色素活性會排在第一位，南極紅色素活性和紫蘇色素活性相當，而胭脂蟲紅色素活性最低。在試驗過程中我們也發(fā)現(xiàn)了不足之處，4種天然色素的各項測試指標均低于同等條件下的VC測定值。一個原因是試驗中使用的天然色素提取物的純度不足。筆者認為，提高天然色素的純度或者增加天然色素的使用濃度可彌補此方面的不足。

就南極紅色素而言，在濃度為1 mg/mL時，南極紅色素對DPPH自由基清除率可達到73.1%、對超氧陰離子自由基清除率為26.5%、對羥基自由基清除率達到67.3%。這些數(shù)據(jù)都充分說明了南極紅色素具有抗氧化的生理活性功能，為南極紅色素的推廣和應用提供了有利的理論支持。南極紅色素是本實驗室自南極土壤樣品中純化得到的真菌所分泌的色素。經(jīng)處理后，每升發(fā)酵液可以獲得1.7 g紫紅色色素干品粗粉[12]，在同類產(chǎn)色素真菌中具有相當明顯的優(yōu)勢。前期的實驗研究表明，南極紅色素的穩(wěn)定性、溶解性等方面都有明顯的優(yōu)勢。本實驗室正在對南極紅色素進行純化，探明其主要成分，提高純度。南極紅色素是一種真菌色素，利用真菌生產(chǎn)色素有其獨到的優(yōu)勢，例如，真菌易于培養(yǎng)、不受季節(jié)限制；生產(chǎn)工藝簡單、周期較短；成本較低等。單純從植物（例如，紫甘藍和紫蘇）或者動物（胭脂蟲）獲得天然色素已經(jīng)不能滿足高速發(fā)展的食品行業(yè)，利用真菌生產(chǎn)色素會逐漸成為一種趨勢。

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The Comparison of Reducing Capacity and Antioxidant Activity of Three Natural Pigments from Antarctic Red Pigment

ZHAO Qian1，WANG Neng-fei2，ZHANG Mei1，JIN Bin-bin1，WU Zuo-hao2，ZANG Jia-ye2，*
（1.School of Pharmacy.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine（TCM），Key Laboratory of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic research，development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，Sichuan，China；2.The First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，Shandong，China）

The aim of this work was to study the reducing power and antioxidant activity of four natural pigments，which were Antarctic red pigment，cochineal pigment，purple cabbage，folium perilliae.The resultsshowed that they had reducing capacity and antioxidant activity.When the content was 1mg/mL，the maximum scavenging rates on superoxide anion radicals were 26.52%，20.51%，15.32%，30.65%，the maximum scavenging rates on DPPH were 73.11%，16.23%，94.64%，96.92%，the maximum scavenging rates on hydroxyl radicals were 67.31%，42.03%，72.67%，58.37%.Therefore，the nature pigments with antioxidant activity and reducing capacity，especially the fungi pigments Antarctic red pigment，will have broad prospects in application.

Nature pigments；Antarctic red pigment；Reducing Capacity；Antioxidant Activity

2013-08-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.029

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金南極紫紅色素的開發(fā)及提取工藝研究；南北極環(huán)境綜合考察與評估專項站基生物生態(tài)環(huán)境本底考察（CHINARE 2014-02-01）；南北極環(huán)境綜合考察與評估專項生物生態(tài)環(huán)境本底考察（CHINARE 2014-04-01）資助

趙倩（1987—），女（漢），碩士研究生，長期從事天然產(chǎn)物與天然色素研究。