轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA耐鹽變異水稻SSH文庫(kù)的構(gòu)建及部分基因特異表達(dá)

肇瑩　肖軍　楊鎮(zhèn)等

摘要：通過(guò)花粉管通道轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA到水稻遼星1號(hào)中，以獲得的2個(gè)耐鹽變異水稻品系H1、H2為材料，對(duì)6張葉的水稻幼苗進(jìn)行0.3%濃度的NaCl溶液誘導(dǎo)處理24 h。提取經(jīng)NaCl溶液誘導(dǎo)后的葉片mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，經(jīng)過(guò)酶解后加接頭和2次雜交，構(gòu)建差異表達(dá)的抑制消減（SSH）cDNA文庫(kù)。以NaCl溶液誘導(dǎo)后的耐鹽變異水稻H1、H2的cDNA為檢測(cè)子（tester），以水稻遼星1號(hào)cDNA為驅(qū)動(dòng)子（driver）。所構(gòu)建的文庫(kù)容量分別達(dá)到了240、281個(gè)，表明所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量良好。對(duì)文庫(kù)中克隆進(jìn)行測(cè)序分析，在NCBI水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得了15個(gè)沒(méi)有同源性的EST序列，其中9個(gè)EST序列功能與植物的抗鹽性有關(guān)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了蘆葦總DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到水稻中，使水稻獲得了抗鹽性。

關(guān)鍵詞：水稻；蘆葦；抑制消減雜交；cDNA文庫(kù)；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0013-04

我國(guó)沿海鹽漬稻區(qū)常利用鹽水灌溉，過(guò)量施用肥料導(dǎo)致土壤鹽分積累以及水稻產(chǎn)量下降[1]。因此，選育耐鹽的水稻新品種、充分開發(fā)利用鹽堿地對(duì)于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增收、保障糧食安全具有重要的意義[2-3]。通過(guò)生物技術(shù)手段可以加速耐鹽水稻品種選育進(jìn)程，但是耐鹽目的基因的轉(zhuǎn)入由于存在基因克隆、質(zhì)粒構(gòu)建等一系列問(wèn)題而受到限制。筆者將具有耐鹽性狀的蘆葦總DNA通過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)導(dǎo)至水稻中，經(jīng)過(guò)幾代的人工海水篩選獲得2個(gè)穩(wěn)定耐鹽的水稻品系。抑制消減雜交（suppression subtra ctive hybridization，SSH）技術(shù)是一種篩選、分離差異表達(dá)基因的方法[4-5]，目前已在小麥[6]、水稻[7-9]、馬鈴薯[10]、紫稈檉柳[11-12]、楊樹[13]等多種植物中得到廣泛應(yīng)用。本研究以2個(gè)耐鹽變異水稻為材料，構(gòu)建水稻抑制消減雜交文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，旨在為通過(guò)花粉管通道轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA獲得耐鹽變異水稻提供可靠的分子生物學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為遼星1號(hào)水稻轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA獲得的2個(gè)耐鹽變異品系后代H1、H2，用濃度為0.3%的NaCl溶液對(duì)其誘導(dǎo)處理24 h。將處理完的水稻倒數(shù)第3張葉片經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。植物總RNA提取試劑盒、Taq DNA 聚合酶、超純dNTP（10 mmol/L）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅢ購(gòu)自 Invitrogen 生物技術(shù)有限公司；pGEM-T easy克隆試劑盒購(gòu)自Promega公司；LA Taq DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Xygen公司；其他生化試劑購(gòu)自Sigma公司；引物由Invotrigen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA的提取與純化

分別取濃度為0.3%的NaCl溶液誘導(dǎo)處理24 h的耐鹽變異水稻H1、H2和對(duì)照遼星1號(hào)葉片100 mg，加入液氮充分研磨成粉末，參照天根生化科技（北京）有限公司植物總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取純化總RNA。對(duì)純化后的RNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察提取物質(zhì)量。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品濃度。RNA樣品濃度計(jì)算公式如下：

RNA原液濃度（ng/μL）=D260 nm×稀釋倍數(shù)×40。根據(jù)D260 nm/D280 nm比值估測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.2 SSH cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈。以cDNA第1鏈為模板合成雙鏈cDNA，利用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化雙鏈cDNA。采用Rsa Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行單酶切，酶切后用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化與濃縮，取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分別以耐鹽變異水稻H1、H2為檢測(cè)子（tester），對(duì)照遼星1號(hào)為驅(qū)動(dòng)子 （driver）進(jìn)行SSH雜交，構(gòu)建耐鹽變異水稻特異表達(dá)基因的正向cDNA文庫(kù)。將SSH-PCR純化產(chǎn)物做TA克隆、藍(lán)白斑篩選，挑選白斑單菌落在37 ℃氨芐青霉素抗性條件下培養(yǎng)，提取質(zhì)粒以通用引物T7（5′-TAATACGACTCACTC TATAGGG-3′）測(cè)序，得到EST序列。將測(cè)序得到的EST序列在NCBI水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)。

1.2.3 RT-PCR驗(yàn)證

對(duì)SSHcDNA文庫(kù)中篩選的與水稻cDNA文庫(kù)查找沒(méi)有同源性的EST序列設(shè)計(jì)引物，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，由Invotrigen公司合成引物，采用 RT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證耐鹽變異水稻H1、H2差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽變異水稻H1、H2葉片總RNA純度、質(zhì)量檢測(cè)

將提取的耐鹽變異水稻H1、H2和對(duì)照遼星1號(hào)（CK）總RNA用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。由圖1可知，28 S、18 S條帶清晰。根據(jù)條帶亮度可以判斷，水稻葉片總RNA主要由28 S、18 S組成。同時(shí)譜帶亮度明顯，表明提取的總RNA未被降解，純度較高。D 260 nm/D 280 nm比值為196，大于1.8。由此可知，提取的耐鹽變異水稻H1、H2和對(duì)照葉片總RNA純度較高、質(zhì)量完整，滿足進(jìn)一步抑制消減雜交的要求。

2.2 雙鏈cDNA合成與酶切電泳檢測(cè)

1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，酶切前后條帶大小發(fā)生明顯變化，說(shuō)明酶切效果很好。未經(jīng)酶切的雙鏈 cDNA 大小在0.4～10.0 kb之間呈現(xiàn)彌散帶型，且在750 bp附近有比較清晰的條帶，酶切后的cDNA大小在0.1～2.0 kb呈現(xiàn)彌散帶型，且在100、300 bp附近有比較清晰的條帶，說(shuō)明酶切可以充分進(jìn)行SSH雜交。

2.3 SSH雜交電泳結(jié)果

以2次雜交所得產(chǎn)物為模板進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，耐鹽變異后代H1、H2經(jīng)第1次消減雜交后，對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示：泳道1、3出現(xiàn)彌散帶，并且有主帶出現(xiàn)，雖然主帶不明顯，但也說(shuō)明差異表達(dá)基因已經(jīng)被均衡消減，達(dá)到了去除高豐度基因的目的。在第1次雜交混合物中加入新制備的變性CK cDNA，結(jié)果顯示，第2輪PCR后在泳道2、4中150、300 bp附近有比較清晰的條帶，說(shuō)明經(jīng)過(guò)第2次抑制消減雜交后，已經(jīng)富集誘導(dǎo)表達(dá)cDNA目的片段（圖3、圖4）。

2.4 TA克隆及陽(yáng)性克隆篩選

將第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAGEN PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)所構(gòu)建的抑制消減雜交文庫(kù)進(jìn)行藍(lán)白斑點(diǎn)篩選并計(jì)算重組率[重組率=白色菌落數(shù)/（藍(lán)色菌落數(shù)+白色菌落數(shù)）×100%]，結(jié)果顯示，耐鹽變異水稻H1、H2雜交文庫(kù)重組率分別為962%、932%。隨機(jī)挑選的24個(gè)陽(yáng)性克隆均能擴(kuò)增出單一清晰條帶。H1、H2雜交文庫(kù)插入的片段大小為300～1 000 bp，個(gè)別插入片段大于1 000 bp，平均插入片段大小為400 bp。

2.5 SSH文庫(kù)測(cè)序分析

對(duì)挑選的經(jīng)過(guò)菌落PCR檢測(cè)過(guò)的差異表達(dá)克隆進(jìn)行測(cè)序，以T7（ACGACTCACTATAGGGCTTTTT）為引物。H1文庫(kù)得到240個(gè)高質(zhì)量的EST序列，H2文庫(kù)得到281個(gè)高質(zhì)量的EST序列。將測(cè)序質(zhì)量合格的序列去除序列兩端載體序列、接頭序列后提交到NCBI水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，H1文庫(kù)有234個(gè)EST序列在水稻cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中有很高同源性，6個(gè)EST序列沒(méi)有同源性。H2文庫(kù)有272個(gè)EST序列在水稻cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中有很高的同源性，9個(gè)EST序列沒(méi)有同源性。將獲得的15個(gè)與水稻沒(méi)有同源性的EST序列進(jìn)行功能比對(duì)，其中9個(gè)EST序列與植物抗鹽性有關(guān)，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA獲得的水稻H1、H2、遼星1號(hào)在基因水平上存在差異，蘆葦DNA與抗鹽相關(guān)的基因片段轉(zhuǎn)導(dǎo)到水稻DNA中從而導(dǎo)致其耐鹽性發(fā)生改變（表1）。

2.6 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

選取4個(gè)在水稻cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源性的EST序列與5個(gè)具有與抗鹽性相關(guān)的基因EST序列設(shè)計(jì)引物（表2）。

2.7 RT-PCR驗(yàn)證

從SSH-cDNA文庫(kù)中挑選9個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。提取水稻耐鹽變異新品種以及對(duì)照株的RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用上述步驟中合成的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，部分結(jié)果如圖5所示，X177、X137檢測(cè)引物可從水稻耐鹽變異株中擴(kuò)增出目的條帶，對(duì)照株遼星1號(hào)中沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶，表明遼星1號(hào)變異品系成功轉(zhuǎn)入了蘆葦總DNA。X181、X219、D562檢測(cè)引物在耐鹽變異新品種材料中的表達(dá)量較高，條帶亮度較為明顯，對(duì)照株中的表達(dá)量較低，PCR條帶較暗，目的基因在植株體內(nèi)表達(dá)量不是很高。D23沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明陽(yáng)性克隆特異性弱。X205、D546檢測(cè)引物在遼星1號(hào)以及耐鹽變異株中均擴(kuò)增出了目的片段且豐度相同，這是因?yàn)橄麥p雜交構(gòu)建文庫(kù)時(shí)可能沒(méi)有完全消減掉相同的片段，由此說(shuō)明抑制消減雜交技術(shù)還有待改進(jìn)。X144在對(duì)照遼星1號(hào)中擴(kuò)增出了目的條帶而在水稻耐鹽變異株中沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，表明這個(gè)陽(yáng)性克隆是假陽(yáng)性。為了驗(yàn)證片段的正確性，片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行測(cè)序，將所得的序列與之前的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)均屬于相同的片段。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)花粉管通道將外源DNA導(dǎo)入整體植物是一種簡(jiǎn)單易行的生物技術(shù)，目前已被廣大作物育種工作者用于作物的基因轉(zhuǎn)移[14]。此技術(shù)不但在小麥、棉花、水稻上得以利用，而且在大豆[15]、花生、煙草、白菜、茄子[16]、黃瓜等作物上都進(jìn)行了供體DNA的轉(zhuǎn)移?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)基因技術(shù)初期階段是以總DNA為外源基因供體，雖能引起后代發(fā)生變異，但對(duì)外源DNA進(jìn)入胚囊、卵細(xì)胞或受精卵以及核基因組或細(xì)胞質(zhì)基因組的行為，帶有標(biāo)記基因的質(zhì)?；蚰康幕?qū)牒笳蠙C(jī)理，以及引起特定而廣泛變異的機(jī)制和轉(zhuǎn)化后的表達(dá)與調(diào)節(jié)等問(wèn)題缺乏理論認(rèn)識(shí)，致使國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)其可靠性提出了質(zhì)疑。自從花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)問(wèn)世，最普遍的疑問(wèn)是認(rèn)為變異植株來(lái)自種子混雜、異花授粉或自然突變。本研究首次利用SSH技術(shù)對(duì)水稻通過(guò)花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA獲得的變異后代H1、H2進(jìn)行測(cè)序研究，最終獲得了許多非來(lái)源于水稻的表達(dá)序列標(biāo)簽。未知基因比例高達(dá)300%、34.5%，這些未知基因可能來(lái)源于供體蘆葦DNA片段與水稻合成相關(guān)的新基因。這些EST為最終闡明通過(guò)花粉管通道轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA獲得耐鹽變異后代機(jī)制提供了直接可靠的分子生物學(xué)證據(jù)。

3.1 RNA樣本的制備

構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的全長(zhǎng)cDNA的前提是能提取到結(jié)構(gòu)完整、純度高的總RNA，否則就不能保證所構(gòu)建的文庫(kù)涵蓋90%以上的基因。RNA提取的過(guò)程中，應(yīng)該創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNaseA的環(huán)境，防止RNA降解，并且選擇一種既簡(jiǎn)單又快捷的提取RNA的方法。本研究獲得的總RNA質(zhì)量完整，純度較高，為構(gòu)建高質(zhì)量的耐鹽變異后代H1、H2的cDNA文庫(kù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.2 對(duì)SSH各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控

本試驗(yàn)抑制消減雜交過(guò)程中，由反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及 RsaⅠ 酶切的檢測(cè)，到加接頭后的接頭連接效率分析直到進(jìn)行消減cDNA片段的消減效率分析，都要對(duì)各個(gè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行隨時(shí)監(jiān)控，以保證最終能得到高質(zhì)量的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。接頭連接效率同整個(gè)試驗(yàn)效果直接相關(guān)，接頭連接后，要進(jìn)行接頭連接效率檢測(cè)。

3.3 陽(yáng)性克隆的鑒定

菌斑培養(yǎng)的方法是抗生素、藍(lán)白斑篩選，一般情況下，使用抗生素篩選則空載體不能成活。藍(lán)白斑篩選可以判斷目標(biāo)片斷是否插入到載體中，白斑或者淺藍(lán)斑表示該菌落質(zhì)粒中已經(jīng)含有目標(biāo)片斷。為了能夠更準(zhǔn)確地判斷該克隆是否是有水稻誘導(dǎo)后特異表達(dá)的基因（正交庫(kù)）或者誘導(dǎo)后不表達(dá)或者表達(dá)量減少的基因（反交庫(kù)），應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)目標(biāo)基因的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

3.4 EST序列的分析

RT-PCR把以RNA當(dāng)作模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，是一種快速靈敏的分析基因表達(dá)的方法，主要應(yīng)用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)，除此之外還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)的差異，相比于其他包括RNase保護(hù)分析、Northern印跡、原位雜交以及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)更加靈敏，更加便于操作。本試驗(yàn)利用RT-PCR差異片段進(jìn)行擴(kuò)增，可以有效避免DNA擴(kuò)增過(guò)程所帶來(lái)的內(nèi)含子的影響，從而可以更高效、快速地驗(yàn)證差異片段的正確性。

3.5 EST序列的分析

泛肽（ubiquitin）是存在于真核細(xì)胞中含有76個(gè)氨基酸殘基的高度保守序列的小肽。泛肽途徑是真核細(xì)胞選擇性降解蛋白質(zhì)的1種級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑，不但能降解變性的、異常的或短命的蛋白，還能降解植物色素、內(nèi)膜蛋白、細(xì)胞周期蛋白等天然蛋白、轉(zhuǎn)錄因子，因而在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、蛋白的降解、蛋白穩(wěn)定狀態(tài)的調(diào)節(jié)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期的控制等過(guò)程中有重要作用。泛素類蛋白被各種脅迫所誘導(dǎo)而表達(dá)且該家族成員對(duì)脅迫反應(yīng)是相互獨(dú)立的。菜豆泛肽基因能響應(yīng)高溫、水楊酸、病毒侵染等脅迫，表明菜豆的泛肽水解途徑在清除脅迫條件下累積的損傷蛋白和介導(dǎo)植物的抗逆性具有重要作用。本研究所獲EST序列（登錄號(hào)：NM_001156199.1）與玉米泛素結(jié)合酶、EST序列（登錄號(hào)：XM_002265287.2）的同源性較高。鹽脅迫對(duì)光反應(yīng)的影響主要是對(duì)光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）以及電子傳遞的影響，通常認(rèn)為PSⅡ是光抑制的原初位點(diǎn)及主要作用部位。PSⅡ能介導(dǎo)非循環(huán)電子傳遞，而且是進(jìn)行水光解放氧的部位，在光合作用響應(yīng)環(huán)境脅迫中起著極為關(guān)鍵的作用。本研究所得到的EST序列（登錄號(hào)：XM_002518218.1）與蓖麻PSⅡ葉綠素a P680假定蛋白的同源性較高。有學(xué)者認(rèn)為，逆境脅迫下蛋白水解酶活性上升同清除因脅迫而產(chǎn)生的畸變蛋白（aberrantproteins）有關(guān)。研究表明，大麥根系蛋白水解酶活性在鹽脅迫處理下下降，這可能是因?yàn)樾纬闪司哂械鞍酌敢种苿┳饔玫柠}適應(yīng)蛋白，在鹽脅迫條件下維持根系中較高的蛋白質(zhì)含量。本研究所獲EST序列（登錄號(hào)：XM_003580628.1）與二穗短柄草的ATP依賴的Clp蛋白水解酶的同源性較高。

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