溪黃草多糖的微波提取及其抗氧化性研究

許麗麗，沈楚椰（韓山師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東潮州521041）

溪黃草多糖的微波提取及其抗氧化性研究

許麗麗，沈楚椰
（韓山師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東潮州521041）

摘要：研究微波法提取溪黃草多糖的最佳工藝條件并測(cè)定其抗氧化活性。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，對(duì)溪黃草多糖還原能力及清除H2O2能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，溪黃草多糖的最佳提取條件為：微波功率480W、微波時(shí)間75 s、料液比1∶35（g/m L）、浸提次數(shù)2次，此條件下多糖得率為12.07mg/g，溪黃草多糖具有良好的抗氧化活性。該法操作便捷，耗時(shí)少，條件溫和，為溪黃草資源開發(fā)利用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：溪黃草；多糖；微波提?。豢寡趸钚?/p>

溪黃草[Rabdosia serra（Maxim.）Hara]，別名溪溝草、山羊面等，為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜的全草，盛產(chǎn)于我國廣東、廣西等省區(qū)。溪黃草具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀等功效，是一種常見的民間草藥，其水提物常用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎伴黃疸者、急性肝炎、腸炎和痢疾等[1-4]。目前已經(jīng)開發(fā)出多種以溪黃草為主要原料的保健品如溪黃草沖劑、溪黃草袋泡茶等，但決定溪黃草功效的主要化學(xué)成分仍有待深入研究[5]。溪黃草多糖作為溪黃草水提物的主要成分之一，可能也是溪黃草藥效的關(guān)鍵成分，但目前對(duì)其研究甚少。本試驗(yàn)利用微波提取法省時(shí)、高效、溶劑耗量少等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，將微波技術(shù)應(yīng)用于提取溪黃草多糖并測(cè)定提取物的抗氧化活性，為溪黃草的藥理研究和深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

溪黃草購于潮州市的環(huán)城西路診所，60℃烘干、粉碎、過40目篩，經(jīng)石油醚（60℃～90℃）回流脫脂2次（1 h/次），再用80%乙醇回流除雜2次（1.5 h/次）。然后烘干至恒重，置于干燥器中備用。

1.2儀器與試劑

WD800B型格蘭仕微波爐：順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3試驗(yàn)方法（平行試驗(yàn)3次，取平均值）

1.3.1溪黃草多糖提取工藝流程

微波提取→趁熱減壓抽濾→濾液濃縮至1 m L～3 mL→加4倍量95%乙醇充分?jǐn)嚢琛?℃冷藏靜置3 h→離心15min（3 000 r/min）→沉淀用95%乙醇洗滌→savage法除蛋白[8]→過濾→適當(dāng)稀釋后進(jìn)行多糖含量測(cè)定。

1.3.2溪黃草多糖含量的測(cè)定

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-10]

準(zhǔn)確稱取葡萄糖（105℃烘干至恒重）0.104 9 g，用蒸餾水溶解并定容至100mL，搖勻得葡萄糖儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10mL于10mL比色管中，定容，得濃度分別為0.010 49、0.031 47、0.052 45、0.073 43、0.094 41，0.115 39mg/m L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)液各1mL于試管中，加入1mL 5%苯酚（重蒸）溶液混合后，迅速加入5mL濃硫酸，混勻后靜置5min，沸水加熱15min，取出后用自來水冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)吸光度。取1mL蒸餾水代替儲(chǔ)備液做空白。以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.3.2.2多糖含量的測(cè)定

取經(jīng)稀釋的溪黃草多糖溶液1mL，按1.3.2.1所述方法測(cè)定吸光度A。根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖的含量。式中：c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度，mg/mL；V為溪黃草多糖溶液稀釋后的總體積，m L；W為提取多糖時(shí)稱取的溪黃草質(zhì)量，g。

1.3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)（平行試驗(yàn)3次，取平均值）

溪黃草多糖提取的單因素試驗(yàn)：固定其它條件，分別考察微波功率、微波時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對(duì)溪黃草多糖得率的影響。每次稱取約1.0000 g干燥的溪黃草樣品，先在料液比1∶30（g/mL），微波時(shí)間為60 s，微波功率分別為160、320、480、640、800W的條件下提取1次，研究微波功率對(duì)榕須多糖得率的影響。接著在初定最佳功率，料液比1∶30（g/mL），微波時(shí)間分別為30、60、90、120、150s的條件下各浸提1次，研究微波時(shí)間對(duì)榕須多糖得率的影響。再在初定最佳功率和時(shí)間，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/m L）的條件下各浸提1次，根據(jù)其多糖得率選擇最佳料液比。最后在初定最佳功率、時(shí)間和料液比的條件下，研究提取次數(shù)（1次～4次）對(duì)多糖得率的影響。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，按照4因素3水平進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，采用直觀分析方法，以極差大小確定因素主次順序。

1.3.4抗氧化性的測(cè)定

1.3.4.1還原能力的測(cè)定

在1.25m L pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入溪黃草多糖樣品液1.25mL，1%的鐵氰化鉀溶液1.25mL，混合物在50℃恒溫20min，再加入1.25mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min離心分離10min，取上清液2.5mL加蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，在700 nm處測(cè)定吸光度[11-12]。以同濃度的VC和硫脲水溶液作對(duì)照。

1.3.4.2清除H2O2能力的測(cè)定[13]

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制10mmol/L的H2O2溶液，取2.5mL上述溶液加入2.5mL溪黃草多糖的樣品液。混勻后在248 nm處測(cè)得的吸光度為A1，試驗(yàn)中以不加樣品液的H2O2溶液吸光度為A0，以不加H2O2的樣品溶液吸光度為A2。則H2O2清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.3.2.1所述方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性擬合，得其線性回歸方程為：y=8.7584x+0.029 0，式中x表示葡萄糖的濃度c（mg/mL），y表示吸光度A。線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，即葡萄糖含量在0.010 49mg/m L～0.115 39mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1微波功率的影響

微波功率對(duì)溪黃草多糖得率的影響如圖1所示。

圖1　微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.1　Effectsofm icrowave power on the yield of polysaccharides

溪黃草多糖得率先是隨著微波功率的增大而明顯增加，這是由于微波功率增大，浸提液的溫度快速提升，有利于溪黃草多糖較快地?cái)U(kuò)散到溶劑中。但當(dāng)微波功率大于480W，溪黃草多糖得率降低?？赡苁怯捎谳腿」β蔬^高導(dǎo)致局部溫度過高破壞了多糖的結(jié)構(gòu)。因此，微波功率初步確定為480W。

2.2.2微波時(shí)間的影響

微波時(shí)間對(duì)溪黃草多糖得率的影響見圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effectsofm icrowaveextraction tim e on the yield of polysaccharides

由圖2可知，溪黃草多糖得率先是隨著微波時(shí)間的增加而增大，當(dāng)微波時(shí)間在60 s時(shí)，提取效果最好。當(dāng)微波時(shí)間超過60 s，溪黃草多糖得率反而有所下降，這是由于開始時(shí)微波時(shí)間的增加有助于溪黃草多糖完全溶出，但當(dāng)加熱時(shí)間過長則會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)受到破壞。因此初步確定微波時(shí)間為60 s。

2.2.3料液比的影響

料液比對(duì)溪黃草多糖得率的影響見圖3。

圖3　料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Effectsofsolid-liquid ratio on theyield of polysaccharides

料液比為1∶40（g/mL）時(shí)達(dá)到峰值，提取溶劑過少會(huì)導(dǎo)致溪黃草多糖與水之間的濃度差過小，不利于多糖的充分浸出。而提取溶劑過多，溶液不易達(dá)到有效的浸提溫度，而且會(huì)增加提取液后期的濃縮和純化時(shí)間，從而不利于多糖的提取。所以，初步選擇1∶40（g/mL）作為最佳料液比。

2.2.4浸提次數(shù)的影響

浸提次數(shù)對(duì)溪黃草多糖得率的影響如圖4所示。

溪黃草多糖的提取量隨浸提次數(shù)的增加而增大，但提取2次以后多糖得率增加已經(jīng)不太明顯。若以4次浸提多糖得率作為溪黃草多糖總含量，則浸提2次，多糖提取量已達(dá)到93%，所以初步確定提取2次為宜。

圖4　浸提次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Effectsof extraction timeson theyield ofpolysaccharides

2.3正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)初步確定提取溪黃草工藝條件為功率480W、時(shí)間60 s、料液比1∶40（g/mL）、浸提次數(shù)2。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)因素水平表進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1　Designm ent and resultsofor thogonalexperiment

由極差R分析可知，影響多糖得率的各因素主次順序?yàn)椋何⒉üβ?浸提次數(shù)>料液比>微波時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B3C1D2，正好為正交中的6號(hào)試驗(yàn)，該條件下多糖得率為12.07mg/g。故最優(yōu)條件為微波功率480W、微波時(shí)間75 s、料液比1∶35（g/m L）、浸提次數(shù)2次。

2.4溪黃草多糖溶液的抗氧化性

2.4.1溪黃草多糖的還原能力

鐵氰化鉀能被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀在酸性條件下能與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)（λmax= 700 nm）[12]。故吸光度越大，反映溪黃草多糖還原能力越強(qiáng)。溪黃草多糖的還原能力如圖5所示。

圖5　3種溶液的還原能力Fig.5　Reducing power of three solutions

在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，溪黃草多糖溶液、VC和硫脲溶液的還原能力均隨濃度的增大而線性增強(qiáng)，線性擬合方程如下：溪黃草多糖提取液y=5.379 9x+0.150 5 （R2=0.985 7）；VC溶液y=11.768 8x-0.020 5（R2=0.995 3）硫脲溶液y=4.089 3x+0.042 8（R2=0.968 6）。三者還原能力的強(qiáng)弱順序是：VC溶液>溪黃草多糖提取液>硫脲溶液。

2.4.2溪黃草多糖清除H2O2的能力

為了避免樣品本身的紫外吸收影響測(cè)定結(jié)果，本試驗(yàn)以不加H2O2的樣品吸光度為空白，按照試驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算清除率，溪黃草多糖清除H2O2的結(jié)果如圖6所示。

圖6　3種溶液對(duì)H2O2的清除率Fig.6　Removing H2O2capacity of threesolutions

在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，3種溶液對(duì)H2O2的清除率均隨濃度的增大而增加，VC和硫脲清除H2O2的能力較接近，溪黃草多糖提取液也顯示出一定的清除H2O2能力，但比VC和硫脲的清除能力弱。

3　結(jié)論

微波法提取溪黃草多糖的最優(yōu)條件為：微波功率480W、微波時(shí)間75 s、料液比1∶35（g/mL）、浸提次數(shù)2次，此條件下多糖得率為12.07mg/g。作為水提物主要成分之一的溪黃草多糖具有良好的抗氧化活性，具有開發(fā)為功能性食品的潛力，而目前對(duì)溪黃草的開發(fā)利用僅局限于其水煎煮粗提物的使用?？傊S草具有廣闊的藥品、食品和保健品開發(fā)前景，有關(guān)溪黃草的各項(xiàng)研究有待進(jìn)一步深入。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.018

收稿日期：2014-04-01

作者簡介：許麗麗（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：分離科學(xué)與技術(shù)。

Study on the M icrowave Extraction and An tioxidant Activities of Polysaccharides from Rabdosia serra（M axim.）Hara

XU Li-li，SHENChu-ye
（College ofChemistryand Environmental Engineering，Hanshan NormalUniversity，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Abstract：The optimum extraction conditionsand antioxidantactivitiesofpolysaccharides from Rabdosia serra （Maxim.）Hara was studied.The extraction conditions were optimized by the single factor experiments and orthogonal experiments.Then the antioxidantactivities of polysaccharideswere determined by the experiments of reducing capacity and removing H2O2capacity.Results indicated that the bestextracting conditionswere as follows：microwave power 480W，treatment time 75 s，ratio ofmaterial to solventwas 1∶35（g/mL）and extraction 2 times.Under this condition，the extraction rate of polysaccharides was 12.07 mg/g.The extracts showed obviousantioxidantactivities.Thismethod was simple，time-saving，undermild conditions.It provides ascientific basis for the exploitation and utilization of Rabdosia serra（Maxim.）Hara.

Keywords：Rabdosiaserra（Maxim.）Hara；polysaccharide；microwave extraction；antioxidantactivity