8周有氧運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響

張穎++梁美楊

摘要：通過探討8周的有氧運動對雌性大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響，探究體育鍛煉是否通過改善細胞凋亡的能力從而延緩了細胞衰老。按照月齡將大鼠分為青年組、中年組、老年組，每個年齡又分為運動組和對照組。運動組大鼠每日進行1h的跑臺運動，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。8周后，處理動物，取大鼠骨骼肌，通過免疫組化技術，定量分析大鼠骨骼肌BCL-2、BAX的含量。結(jié)論發(fā)現(xiàn)：所有大鼠骨骼肌中均存在細胞凋亡現(xiàn)象。隨著年齡增長，老年組大鼠骨骼肌細胞凋亡呈明顯上升趨勢（P<0.01）。有氧運動對青年組大鼠骨骼肌細胞凋亡有促進作用（P<0.05），老年運動組大鼠骨骼肌細胞凋亡則有下降的趨勢（P>0.05）。年齡和有氧運動的交互作用證明：8周有氧運動對促進青年組大鼠骨骼肌新陳代謝、延緩老年組大鼠肌細胞萎縮有積極作用。

關鍵詞：有氧運動；大鼠；骨骼??；細胞凋亡

中圖分類號：G804 文獻標識碼：A 文章編號：1008-2808（2015） 02-0087-05

Abstract：Through an investigation of 8 weeks aerobic exercise influence on female rat skele-tal muscle cell apoptosis. To explore whether the physical exercise by improving the ability ofthe cell apoptosis and delayed the senescence of cells. methods According to months rats di-vided into young， middle - aged and elderly group. Every age is divided into exercise groupand control group. Exercise group rats run daily for l hour's motion， the control group con-ventional breeding. After eight weeks， handle animal， in rat skeletal muscle， using immuno-histochemical techniques， quantitative analysis of rat skeletal muscle the BCL-2， BAXlevels. Conclusion all the rat skeletal muscle apoptosis phenomenon exists. As we age， eld-erly group rats skeletal muscle apoptosis showed a trend of increased obviously （P<0.01）.Aerobic exercise for youth promote skeletal muscle cells apoptosis in rats （P<0.05）， theolder group rats skeletal muscle apoptosis is the trend of decline （P>0.05 ） . Age and the in-teraction of the aerobic exercise to prove： 8 weeks aerobic exercise to promote young rat skel-etal muscle metabolism， delay the elderly group muscle atrophy in rats have a positive effect.

Key words：Aerobic exercise ； Rats ； Skeletal muscle ； Cell apoptosis ；

有氧運動是由Kennth H.Cooper博士于1968年倡導的，顧名思義就是在有氧代謝狀態(tài)下做運動，在運動過程中，人體吸人的氧氣與需求相等，達到生理上的平衡狀態(tài)。作為運動人體科學領域的研究重點，科研人員在諸多領域?qū)τ醒踹\動進行了深入的研究，也取得了長足的進展。細胞凋亡是指在生命體發(fā)育、生長、衰老過程中，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而對不同有害刺量的應答，或在疾病中所產(chǎn)生的一種特殊的，受核DNA控制的細胞自殺行為。由此可見細胞凋亡是一種主動的、由遺傳控制的程序性現(xiàn)象，故也稱為細胞程序化死亡。細胞凋亡是受基因控制的。根據(jù)所起作用可將參與調(diào)控細胞凋亡的基因分為促進凋亡基因和抑制凋亡基因。BCL-2就是抑制細胞凋亡的典型基因，而BAX則屬于促進凋亡亞族的一員。

運動與骨骼肌密切相關。人體的各種運動都是在骨骼肌的收縮下完成的。因此對于骨骼肌的研究一直是運動人體科學領域的重點。但通過查閱資料發(fā)現(xiàn)：對于骨骼肌的研究多集中在生理生化領域，針對骨骼肌細胞凋亡的研究文獻較少。因此，本文通過實驗，闡述有氧運動對增齡SD大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象及分組

不同月齡雌性SD大鼠60只，購白黑龍江中醫(yī)藥大學動物安全評價中心，標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。飲食飲水自由，動物房內(nèi)溫度18℃～ 25℃，相對濕度40%～50%。白然光照，保證動物房安靜，整潔，通風。每天上午填食、加水、換墊料。按照月齡將SD大鼠分為青年組（3個月左右）20只，（6個月左右）20只，老年組（13個月左右）20只。將每組大鼠隨機抽取10只作為實驗組，10只作為對照組。實驗組和對照組體重、體質(zhì)均無顯著性差異。

1.2 實驗方案

實驗組大鼠適應性飼養(yǎng)一周，然后進行適應性跑臺訓練20min。第二天進行篩選：跑臺坡度0°，速度15m/min，運動60min。凡不能完成或完成但出現(xiàn)異常表現(xiàn)者（如運動不協(xié)調(diào)、長時間趴在跑臺帶上、有明顯傷口及出血者）淘汰。接下來參照T.G.Bedford等方法，采用中等強度運動訓練。跑臺坡度00，lh/次，1次/日，每周6次，休息1天，共8周。跑速逐漸遞增。開始速度為10 m/min，lOmin后速度增加至11 m/min。以此類推，每個速度均跑10min，最后調(diào)整至15m/min。不能完成測試者淘汰。選材時沒有大鼠被淘汰。對照組常規(guī)飼養(yǎng)。endprint

1.3 動物取材及細胞凋亡的檢測

1. 3.1 動物取材 各組大鼠在8周實驗結(jié)束后進行取材，取材前一天禁食。配制10%的水合氯醛溶液作為麻醉劑。麻醉劑量根據(jù)體重決定，每千克注射350ml水合氯醛。麻醉后，把大鼠固定在手術臺上，剪開下肢皮膚，取腓腸肌作為實驗樣本。在生理鹽水中沖洗后，保存至福爾馬林溶液中。

1.3.2 制作蠟塊 將泡在福爾馬林中的腓腸肌橫切，厚度約3mm左右。切好的肌肉置于模具中，用自來水沖洗th。然后脫水：70%乙醇1 h→80%乙醇Ⅰh→90%乙醇過夜→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min。

骨骼肌脫水后浸蠟，在70℃的溫箱中，將組織分別放在液體臘（一）1.5 h→液體蠟（二）1.Sh→液體蠟（三）1h。

將溶化好的純臘倒在制蠟塊的模具中，把浸好蠟的肌肉組織放入其中，室溫條件下過夜。第二天蠟塊即可制成。蠟塊修理后用YD-1508B輪轉(zhuǎn)式切片機把蠟塊切成7μm的蠟片。在溫水浴中展片、用載玻片撈片、用DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱把片子烘干。石蠟切片即制作完成。

1. 3.3 細胞內(nèi)基因蛋白表達的檢測 通過試劑和抗體來檢測大鼠腓腸肌組織內(nèi)bcl-2和bax的基因蛋白表達。試劑盒購白武漢博士德公司?？贵w為PV6001（山羊抗或兔1gG抗體-HRP多聚體）。主要步驟如下：

（1）脫蠟、水化組織切片：二甲苯15min→二甲苯Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ5min→100 %乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇Smi0→70%乙醇5min→水5min→PBS沖洗2次，每次5min→抗原修復→室溫下晾涼。

注：PBS濃度為0.02mol/L，PH值7.2～7.6。具體配置方法：精確稱取并在燒瓶中依次加入Nac19g，Na2HP04 12H206g，NaH2P04 2H2O 0.4g，加蒸餾水1000ml，PBS液即配制而成。

注：抗原修復所用檸檬酸鹽緩沖液濃度為0.01 mol/L，PH=6.0。具體配制方法：C6H5Na3072H2O（檸檬酸三鈉）3g，C6H8O7 H2O（檸檬酸）0.4g，加蒸餾水1000ml配制而成。檸檬酸鹽緩沖液的優(yōu)點是染色背景清晰，適用于絕大多數(shù)抗體。抗原修復即把載玻片架置于檸檬酸溶液中，用微波爐加熱4min。加熱過程中試劑不可太少，因為微波爐溫度太高，液體蒸發(fā)過快。試劑也不可太多，有溢出的危險。加熱時給容器加蓋，但需要留出一條縫。

（2）把載玻片置于3%過氧化氫中孵育10min，用PBS沖洗3次，每次2min。

（3）封閉：在組織上滴加羊抗血清封閉，20min后甩去。

（4）滴加一抗，37℃孵育1.5h，或者4℃過夜。然后用PBS沖洗3次，每次2min。（通過預實驗確定一抗的濃度為1：75）

（5）按照一抗的來源，分別加相應的檢測試劑PV6001（山羊抗或兔IgG抗體-HRP多聚體）。在室溫或者37℃溫箱里孵育30min后，用PBS沖洗3次，每次2min。

（6）顯色：滴加DAB顯色劑，5min左右即可。當觀察到組織變成棕色即可判定為陽性細胞?？梢越K止反應。

（7）用蒸餾水充分沖洗2次，每次2min。加蒸餾水即阻斷了反應。

（8）復染、脫水、透明：蘇木素2min→自來水→蒸餾水3min→80%乙醇3min→90%乙醇3min→100%乙醇Ⅰ3min→l00%乙醇Ⅱ3min→二甲苯Ⅰ3min→二甲苯Ⅱ3min

（9）封片：用中性樹脂膠滴在載玻片的組織旁，再用蓋玻片蓋上。

（10）觀察：用光學顯微鏡觀察片子，統(tǒng)計后進行定量分析。

1. 3.4 免疫組化染色統(tǒng)計 Bcl-2、bax的免疫反應產(chǎn)物的標記強度用平均值A來表示。把每組制作的8張骨骼肌組織切片在40×10的放大倍數(shù)下選取3個視野拍照。使用LEICA Q550W圖像分析系統(tǒng)對照片進行分析。從而測定出bcl-2、bax的A值。調(diào)節(jié)系統(tǒng)去除本底后測量特異染色的平均光密度值。用測得的bcl-2、bax蛋白的A值減去背景A值即得到校正A值（CA值）。CA值即為凋亡蛋白免疫反應的實際A值。用CA值進行分析可以避免染色過程中非特異染色所造成的誤差。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

本實驗的數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件包進行處理，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示。采用單因素方差分析進行顯著性差異分析。P<0.05即表示有顯著性差異，P<0.01，為差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗結(jié)果

從表1可以看出青年對照組和青年運動組大鼠的骨骼肌中bcl-2的表達無顯著性差異（P>0.05）。中年組的值整體上雖然略低于青年組，但在中年對照組和中年實驗組織間也沒有體現(xiàn)出明顯差異。老年運動組bcl-2蛋白表達顯著低于老年對照組（P<0.05）。增齡因素對骨骼肌bcl-2的表達影響非常顯著，不同年齡段對照組大鼠比較P<0.01。各年齡段運動組大鼠之間bcl-2有顯著性差異（P<0.05）。

通過表2可知：各年齡段大鼠bax的表達結(jié)果組間比較均無顯著性差異（P>0.05）。對照組大鼠之間差異顯著（P<0.05）。但bax的CA值沒有與年齡呈現(xiàn)線性關系。

青年組促凋亡蛋白因子的表達高于中年組。老年對照組bax顯著高于中青年組。在運動和年齡的雙重因素干預下，各組織間bax的表達有顯著性差異（P<0.05）。運動組大鼠bax值與年齡呈現(xiàn)出線性關系。即隨著年齡的增長，運動組大鼠bax的表達逐漸明顯。

2.2 分析與討論

目前的研究普遍認為，細胞凋亡是一個“瀑布式”基因表達過程，根據(jù)所起的作用將參與調(diào)控細胞凋亡的基因分為促凋亡基因和抑制凋亡基因。以bcl-2為代表的抑制凋亡的因子和以bax為代表的促進調(diào)往因子共同決定了大鼠骨骼肌細胞凋亡情況。白20世紀80年代中期起，對細胞凋亡的研究日益蓬勃發(fā)展起來，所涉及的領域也越來越廣泛。2002年，諾貝爾醫(yī)學與生理學獎授予了在細胞凋亡的研究中有卓越貢獻的三位科學家。此后的10余年，諸多研究人員對細胞凋亡現(xiàn)象進行了全面的研究探索，并取得了一定的進展。但對運動刺激引起細胞凋亡現(xiàn)象的研究還比較滯后。特別是運動對骨骼肌細胞凋亡的研究更是不多見。endprint

本實驗通過對不同年齡的對照組和運動組大鼠細胞凋亡相關蛋白進行檢測，來研究運動、年齡兩個因素與骨骼肌細胞凋亡的關系。機體的各種運動都是依靠骨骼肌的收縮來完成的。骨骼肌是體內(nèi)含量最多的組織，約占體重的40%左右。哺乳動物的骨骼肌會隨著衰老而發(fā)生萎縮。細胞死亡的阻抑基因和啟動基因彼此相互作用，最終結(jié)果依賴于死亡因子與死亡抑制因子的比值。長時間中等強度的有氧運動對骨骼肌細胞凋亡的影響，國內(nèi)外的研究基本都是針對廢用性肌萎縮、肌營養(yǎng)不良和肌肉失重等肌纖維損傷的情況而開展的。有研究證明：骨骼肌細胞凋亡是肌營養(yǎng)不良癥、肌廢用性萎縮以及心力衰竭病人運動耐受力下降的原因。但通過進行長期有氧運動訓練，可以明顯的減弱細胞凋亡的能力，從而延緩由于細胞凋亡增多而導致的廢用性肌萎縮。

如表1所示，各年齡段大鼠骨骼肌bcl-2的表達結(jié)果有顯著性差異。說明年齡對于大鼠肌細胞發(fā)生細胞凋亡有著至關重要的影響。對照組之間差異非常顯著（P<0.01），隨著年齡增長bcl-2的表達逐漸減弱。表2的對照組數(shù)據(jù)也表明：老年大鼠骨骼肌bax的表達顯著高于青年、中年組大鼠。說明年齡越大，肌細胞凋亡蛋白的表達越多。這可以解釋衰老的大鼠骨骼肌萎縮老化、肌纖維減少等現(xiàn)象。關于增齡骨骼肌萎縮與細胞凋亡的關系，國內(nèi)外的報道并不多見。Amie Dirks等對大鼠進行實驗，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠腓腸肌細胞凋亡率比青年大鼠提高50%左右。這與本實驗的研究結(jié)果一致。在運動組中，bcl-2因子的表達在不同年齡段大鼠也有顯著性差異（P<0.05），但沒有對照組變化明顯。Bax的表達隨年齡增加而增加。且形成了顯著性差異（P<0.05）。這說明隨著年齡的增漲，老年大鼠細胞凋亡加速。但是運動可以讓老年大鼠細胞凋亡相關因子的表達可以延緩。

年齡的增漲促進骨骼肌細胞凋亡這一規(guī)律在青年、中年大鼠中并不適用。通過表1和表2的數(shù)據(jù)，可以看到青年、中年組大鼠骨骼肌細胞凋亡因子的表達無顯著性差異。促凋亡因子bax在青年對照組的表達高于中年對照組。這可能是由于青年組大鼠處于生長發(fā)育期，新陳代謝活躍。促凋亡蛋白的活躍表達加快了青年組大鼠肌細胞的更新速率，適應了青年組大鼠骨骼肌在增齡過程中的功能需求。而中年組大鼠骨骼肌的生長趨于穩(wěn)定，因此促凋亡因子的表達低于青年組，這也說明長期有氧運動促進了青年大鼠肌細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。從一個側(cè)面反應了中年大鼠的新陳代謝低于青年大鼠。本文推測，青年大鼠正處于生命旺盛、活動力極強的階段，長期有氧運動促進青年大鼠肌細胞發(fā)生凋亡，使那些衰老退化、功能低下的細胞迅速清除出去；肌細胞凋亡率的增加同時引發(fā)衛(wèi)星細胞進入肌細胞中，產(chǎn)生新的肌原纖維并對損傷的肌纖維進行修復。

總之，有氧運動加快了青年大鼠肌細胞的更新速率，使那些不能適應機體運動需要的細胞在競爭中選擇了凋亡的形式來結(jié)束生命，而那些強健的細胞則保留，滿足青年大鼠肌肉強健的生理需要。通過運動干預，發(fā)現(xiàn)青年運動組、中年運動組大鼠骨骼肌促凋亡因子更加活躍，均高于同年齡段的對照組大鼠。提示有氧運動加快了青年和中年大鼠骨骼肌新陳代謝。細胞凋亡是生物體細胞死亡的一種獨特方式，在骨骼肌生長發(fā)育過程中，細胞凋亡對肌細胞的數(shù)量、質(zhì)量均起到重要的調(diào)節(jié)作用。對于長期有氧運動對于肌細胞的影響，李爽通過實驗得出結(jié)論：長期有氧運動可以明顯誘導青年組大鼠骨骼肌發(fā)生細胞凋亡，從而加快了肌細胞的更新速率。運動可以明顯抑制老年組大鼠細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，從而延緩了由于白然增齡引發(fā)的肌纖維萎縮等現(xiàn)象的發(fā)生。這與本文實驗結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本實驗各組大鼠骨骼肌均存在細胞凋亡現(xiàn)象。老年組大鼠骨骼肌細胞凋亡現(xiàn)象最為明顯。這可能是導致肌肉萎縮、肌細胞減少等衰老現(xiàn)象出現(xiàn)的原因之一。青年組大鼠骨骼肌細胞凋亡情況比中年組大鼠明顯，這可能是青年組大鼠新陳代謝旺盛所導致的。

年齡和有氧運動的交互結(jié)果證明，中等強度的有氧運動可以促進中青年雌性大鼠骨骼肌細胞凋亡的發(fā)生，使機體肌肉保持在較高的新陳代謝水平上。同時可以有效延緩增齡導致的細胞凋亡率上升，從而延緩骨骼肌萎縮的趨勢。

本實驗采用的大鼠均是自然增齡的樣本，因此實驗結(jié)果對于人也有借鑒意義?；趯嶒灲Y(jié)論，建議各年齡段的人均可以采取中等強度有氧運動的方式來進行強身健體。特別是老年人，適當?shù)倪\動能夠增強肌肉功能，提高肌肉能力。

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