新疆加工番茄上南方番茄病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達

張 強，崔百明，鄭銀英，向本春

(石河子大學 生命科學學院 農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832003)

新疆加工番茄上南方番茄病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達

張 強，崔百明，鄭銀英，向本春

(石河子大學 生命科學學院 農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832003)

【目的】 克隆南方番茄病毒(STV)的外殼蛋白(CP)基因，構建其原核表達載體并進行誘導表達，為制備檢測該病毒的高效價血清提供參考。【方法】 利用一步法RT-PCR從新疆加工番茄上克隆STVCP基因，將其連接到原核表達載體pET-28a(+)上，獲得重組質粒pET-28a-STV CP。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21后用IPTG進行誘導表達?！窘Y果】 成功克隆了STVCP基因，其長度為1 134 bp。構建了原核重組表達質粒pET-28a-STV CP，其在1 mmol/L IPTG誘導下，成功表達出分子質量約47 ku的蛋白。【結論】 成功克隆了STVCP基因，并誘導了pET-28a-STV CP重組蛋白的原核表達。

南方番茄病毒；外殼蛋白基因；原核表達

加工番茄屬于普通番茄的一種類型，在新疆有“紅色產業(yè)”之稱。近些年，隨著種植面積的逐年加大，加工番茄已成為新疆經濟的支柱性產業(yè)之一，也是新疆經濟增長速度最快的產業(yè)之一[1-2]。

加工番茄由于枝繁葉茂、種植密度大、品種抗病能力不一、栽培時間長、連作和重茬地增多等因素，導致其病毒病日趨嚴重。對加工番茄的病毒病進行調查發(fā)現(xiàn)，加工番茄病毒病類型主要有花葉型、蕨葉型、條斑型、巨芽型、卷葉型和黃頂型等。侵染加工番茄的主要病毒有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus，ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)等。在2006-2010年，CMV在新疆北疆加工番茄上的檢出率為21.5%～83.2%；2009-2010年，ToMV、PVY在新疆北疆加工番茄上的檢出率分別為96.7%和24.8%，這些病毒對加工番茄品質和產量產生了嚴重的影響，同時也造成了較大的經濟損失[3-6]。

南方番茄病毒(Southerntomatovirus,STV)是最近報道的一種植物dsRNA病毒，其基因組全長為3 437 nt，在正義鏈上存在部分重疊的2個開放閱讀框(ORF)。雖然STV基因組結構與整體病毒科(Totiviridae)病毒相同，但是兩者在氨基酸序列和二級結構上存在很大差異。利用RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)蛋白全序列及保守區(qū)進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，STV與分體病毒科(Partitiviridae)病毒的親緣關系較整體病毒科病毒更近。因此，STV是一種與整體病毒科病毒和分體病毒科病毒均有親緣關系的植物病毒[7]。

2011年，新疆加工番茄出現(xiàn)STV感染植株。STV是嚴格種傳病毒，不能通過摩擦接種和嫁接等方式傳播，但可通過品種引進、品種培養(yǎng)和良種繁育等過程傳播[8]。因此，建立快速、準確的病毒檢測方法是STV病害監(jiān)控和防治的關鍵。病毒特異性抗血清的制備和應用是目前病毒檢測最有效的手段之一[9-11]。因此，本研究克隆了STV 外殼蛋白(Coat protein,CP)基因，構建其原核表達載體，并進行誘導表達，以期為制備該病毒檢測所需高效價抗血清提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 加工番茄樣品 于2012-08，自新疆石河子蔬菜花卉研究所隨機采集加工番茄，樣品編號為S3-13。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21及表達載體pET-28a(+)，由石河子大學農業(yè)生物技術重點實驗室319室保存。克隆載體pGEM-T Easy Vector，購于Promega公司。

1.1.3 酶與試劑 限制性內切酶NcoⅠ、BamHⅠ，購自Fermentas公司；TaqDNA Polymer-ase，購自Roche公司；T4 DNA連接酶、PCR產物凝膠回收試劑盒，購自Promega公司；質粒提取試劑盒，購自GENOMED公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Agarose-Molecular Biology Grade，購自Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank上的STV全序列(GenBank登錄號：EF442780)設計引物，上游引物5′-CATGCCATGGCTGGTGTCGGAGGTT-3′(下劃線部分為NcoⅠ酶切位點)；下游引物5′-CGCGGATCCACCTCTATCCTTGCGTTGGG-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)。引物預期擴增片段長度為1 134 bp，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA的提取 使用Invitrogen公司TRIZOL Reagent提取加工番茄葉片的總RNA。取適量新鮮葉片于1.5 mL離心管中，加入400 μL TRIZOL，用研磨棒充分研磨，室溫放置5 min，加入80 μL氯仿，振蕩20 s，靜置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取100 μL上清，加入等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入500 μL 體積分數(shù)75%的無水乙醇，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清并收集沉淀，加入20 μL DEPC水，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3CP基因的克隆 使用Invitrogen公司SuperScript?Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum?TaqDNA Polymerase進行一步法RT-PCR擴增。反應體系如下：總RNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，5 mmol/L MgSO40.8 μL，2×Reaction Mix 5 μL，SuperScript?Ⅲ RT/PlatinumTaqMix 0.2 μL，用ddH2O補充至10 μL。試驗同時設立陰性對照，以ddH2O代替模板進行擴增。反應條件為：55 ℃ 15 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，40個循環(huán)；68 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后在凝膠成像儀上觀察結果。使用PCR產物凝膠回收試劑盒回收純化PCR產物，與pGEM-T Easy Vector載體相連接，構建重組質粒pGEM-T Easy-STV CP并轉化DH5α感受態(tài)細胞，利用藍白斑試驗篩選陽性克隆，提取質粒，經NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。質粒測序后，將本研究的CP與NCBI上已公布的STV相關序列進行BLAST比對分析。

1.2.4 原核表達載體的構建 用限制性內切酶NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切陽性重組質粒pGEM-T Easy-STV CP，與經同樣雙酶切的原核表達載體pET-28a(+)連接，獲得重組質粒pET-28a-STV CP，轉化DH5α感受態(tài)細胞，利用藍白斑試驗篩選陽性克隆，提取質粒，進行NcoⅠ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定。

1.2.5CP基因的誘導表達 將重組質粒pET-28a-STV CP轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜活化，1∶100(體積比)稀釋到5 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，分別于2，4，6 h取樣并離心收集菌體，加適量的PBS裂解液振蕩懸浮，再加等體積5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸8 min，SDS-PAGE電泳檢測CP的表達情況。試驗同時設未經IPTG誘導的pET-28a(+)載體、經IPTG誘導的pET-28a(+)載體、未經IPTG誘導的pET-28a-STV CP重組質粒為對照。

2 結果與分析

2.1 STV CP基因的克隆與序列分析

提取的總RNA經電泳檢測，出現(xiàn)3條帶，其中28S和18S條帶較亮，5S條帶較弱，但可以用來進行后續(xù)試驗。一步法RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，樣品在1 134 bp處擴增出明顯條帶(圖1)，長度與預期擴增結果相符，而去離子水陰性對照沒有擴增出相應的片段。

圖1 STVCP基因的一步法RT-PCR擴增
M.DNA Marker DL2000；1.陰性對照；2.CP基因一步法RT-PCR擴增產物
Fig.1 One-Step RT-PCR amplification of STVCP
M.DNA Marker DL2000；1.Negative control；2.Product of STVCPgene

將回收后的STVCP與pGEM-T Easy Vector連接，轉化篩選獲得陽性克隆pGEM-T Easy-STV CP。本研究的CP與NCBI上已公布的STV相關序列分析結果顯示，序列同源性均在99%以上。

2.2 STV CP基因表達載體的鑒定

重組質粒pGEM-T Easy-STV CP用NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切，回收目的片段，定向插入到NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切的pET-28a(+)中，轉化篩選獲得重組質粒pET-28a-STV CP。對重組質粒pET-28a-STV CP進行NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，結果酶切出現(xiàn)約1 134 bp的目的片段(圖2)，表明STVCP基因已連接至pET-28a(+)原核表達載體上。

圖2 重組質粒pET-28a-STV CP的酶切鑒定
M.DNA MarkerⅢ；1.pET-28a-STV CP重組質粒；2.pET-28a-STV CP重組質粒的NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切產物
Fig.2 Enzyme digestion of pET-28a-STV CP withNcoⅠ/BamHⅠ
M.DNA MarkerⅢ；1.pET-28a-STV CP；2.Digestion of pET-28a-STV CP withNcoⅠ/BamHⅠ

2.3 pET-28a-STV CP在大腸桿菌中的誘導表達

取表達產物進行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導后泳道中出現(xiàn)1條非常明顯的蛋白帶，其分子質量約為47 ku，與預期融合蛋白大小相符，且隨著誘導時間的延長，蛋白表達量逐漸增加(圖3)。

3 討 論

在我國，加工番茄的栽培主要集中在新疆，并逐漸發(fā)展到內蒙古、甘肅、寧夏等地區(qū)，推動了這些地區(qū)的經濟發(fā)展。由于病毒病的普遍發(fā)生，加工番茄的品質和產量受到了嚴重影響。因此，病毒病的檢測對于預防和控制病毒病具有非常重要的意義。目前，植物病毒的檢測主要有生物學、血清學和分子生物學等方法。其中，血清學方法因具有快速簡便、靈敏度高、檢測樣品多等優(yōu)點，而成為應用最為廣泛的植物病毒檢測技術之一[12-14]。

圖3 pET-28a-STV CP表達產物的SDS-PAGE電泳
M.低分子質量蛋白Marker；1.未經IPTG誘導的pET-28a(+)載體；2.經IPTG誘導的pET-28a(+)載體；3.未經IPTG誘導的pET-28a-STV CP重組質粒；4～6.分別為1 mmol/L IPTG誘導2，4，6 h的 pET-28a-STV CP 重組質粒
Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression products
M.Low molecular protein Marker；1.pET-28a(+), uninduced；2.Induced pET-28a(+)；3.pET-28a-STV CP, uninduced；4-6.Proteins of pET-28a-STV CP induced by IPTG at 2,4 and 6 h,respectively

STV作為一種新近發(fā)現(xiàn)的植物病毒，其在番茄上的致病癥狀尚不明確。盡管有STV與番茄的退綠、黃化、衰退、果實小等癥狀相關的報道[15]，但是還未證實其直接相關性。因此，目前對STV的檢測主要依賴于分子生物學方法。另外，由于現(xiàn)在尚未分離觀察到STV病毒粒子，所以不能采用以純化病毒粒子或病毒粗提液作為抗原免疫動物的傳統(tǒng)方法來制備其血清學檢測所需的抗體[16]。

相比之下，克隆病毒的一段基因并進行表達，以表達產物作為抗原制備抗體，克服了傳統(tǒng)方法的各種困難，其表現(xiàn)出的特有優(yōu)勢也極大地促進了以免疫學為基礎的病毒檢測技術在病毒監(jiān)控和防治中的應用。大腸桿菌表達體系是植物病毒界表達蛋白最常用的表達系統(tǒng)，它具有成本低、周期短、產量高、表達穩(wěn)定等特點。因此，本研究采用在大腸桿菌中克隆表達重組蛋白功能最強大的pET系統(tǒng)來進行STVCP基因的原核表達，這可使外源蛋白C端與載體上的6個組氨酸相融合，以方便、快捷地通過His Bind柱提取獲得融合蛋白。與切膠回收獲得目的蛋白的方法相比，該方法所獲目的蛋白可縮短后續(xù)試驗抗血清制備過程，且減少了反復SDS-PAGE電泳對蛋白空間結構的破壞[17-18]。

本研究克隆了南方番茄病毒的CP基因，構建了其原核表達載體，并成功地進行了誘導表達，這為進一步制備STV特異性抗血清和建立間接ELISA檢測方法提供了材料，為快速、準確調查STV在新疆等地區(qū)的分布、危害情況及加工番茄產業(yè)的健康發(fā)展具有積極的促進作用。

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Cloning and prokaryotic expression of coat protein gene of Southern tomato virus from processing tomato in Xinjiang

ZHANG Qiang,CUI Bai-ming,ZHENG Yin-ying,XIANG Ben-chun

(CollegeofLifeScience,KeyLaboratoryofAgricultureBiotechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China)

【Objective】 This paper aimed to clone the coat protein (CP) gene ofSoutherntomatovirus(STV),and construct and express its prokaryotic expression vector,providing reference for preparation and detection of high titer serum of the virus.【Method】 The STVCPgene was cloned by One-Step RT-PCR and connected with pET-28a(+) to obtain pET-28a-STV CP.Then the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 and induced by IPTG.【Result】 The STVCPgene was cloned successfully with the size of 1 134 bp and prokaryotic expression vector pET-28a-STV CP was also constructed.TheCPprotein with molecular weight of 47 ku was highly expressed after being induced by 1 mmol/L IPTG.【Conclusion】 STVCPgene was successfully cloned,and the expression of recombinant protein was induced successfully.

Southern tomato virus;coat protein gene;prokaryotic expression

2013-11-28

國家自然科學基金項目(31260420)；國際科技合作與交流專項(20072072)

張 強(1985-)，男，陜西蒲城人，在讀碩士，主要從事植物病毒學研究。E-mail：zhangqiang1047@126.com

鄭銀英(1975-)，女，吉林延邊人，副教授，主要從事植物病毒學研究。E-mail：zyycbm@sina.cn

時間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.001

S432.41

A

1671-9387(2015)04-0118-05

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.001.html