國內(nèi)外李斯特菌檢測(cè)及其快檢技術(shù)的發(fā)展

陶文靖

摘 要：本文比較分析了國內(nèi)外李斯特菌的檢測(cè)方法、不同標(biāo)準(zhǔn)限量值的差異，并介紹了國內(nèi)外李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及存在的問題，對(duì)我國微生物快速檢測(cè)的現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，探討了李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)的未來發(fā)展方向，對(duì)李斯特菌檢驗(yàn)方法探索及快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有一定的借鑒意義。

關(guān)鍵詞：李斯特菌 快速檢測(cè) 免疫學(xué)檢測(cè) 分子學(xué)檢測(cè)

李斯特菌廣泛存在于環(huán)境中，并且在很多食品中有檢出，該菌在低溫的條件下仍能存活和增殖，其中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的主要致病菌之一，也是食品安全控制的重要病原體，感染后會(huì)造成不同程度的人員死亡，受到各國的高度重視。傳統(tǒng)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力而靈敏性較差，因此，快速、高效、靈敏可信的檢測(cè)方法能夠更加有效判定李斯特菌污染風(fēng)險(xiǎn)并且控制其危害。

1 李斯特菌的污染及危害

李斯特菌在環(huán)境中普遍存在，也是污染食品的主要病原菌，往往侵染肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食品，在4℃的環(huán)境中仍能生長繁殖，是冷藏食品中主要的病原菌之一。其中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的重要病原菌，WHO將其列為21世紀(jì)四大食源性致病菌之一[1]。近年來，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病事件時(shí)有發(fā)生（見表1），并造成不同程度的人員死亡，受到了各國的高度重視。

2 國內(nèi)外關(guān)于食品中

李斯特菌限量的規(guī)定

李斯特菌極容易污染食品，其中對(duì)冷藏食品和即食食品危害最為嚴(yán)重，各國均制定了食品中李斯特菌的限量值和監(jiān)測(cè)計(jì)劃。美國對(duì)即食食品中單增李斯特菌的限量規(guī)定為0/25g，并要求企業(yè)實(shí)施GHP和HACCP[2]。中國香港2014年修訂了對(duì)即食食品和指定食品中單增李斯特菌的限量值并分別做了規(guī)定。冷藏食品（冷凝食品除外）或嬰兒食品中單增李斯特菌必須“在25g食物樣本中沒有發(fā)現(xiàn)”，其他即食食品中單增李斯特菌的限量為食物樣本中小于100CFU/g[3]。中國大陸2013年頒布的《食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)GB29921-2013》中規(guī)定[4]，在即食肉制品中，單增李斯特菌按照二級(jí)采樣方法取樣不得檢出（n=5，c=0，m=0）。也有一些國家，如新西蘭等國家并沒有制定相關(guān)的規(guī)定，僅制定了一個(gè)對(duì)人類健康不存在風(fēng)險(xiǎn)的可接受水平。綜上，雖然各國均對(duì)單增李斯特菌做出了限量要求，但是對(duì)李斯特菌的限量各國的要求不一，見表2。

3 國內(nèi)外主要檢驗(yàn)方法

目前，食品微生物檢測(cè)體系主要包括，中國的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4789）和檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN）、國際化標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）方法、美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）、美國農(nóng)業(yè)部（USDA）、美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）、加拿大健康保護(hù)部（MFLP）、歐盟食品安全局（EFSA）等檢測(cè)體系[5]。

食品中單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括增菌、分離和鑒定3個(gè)環(huán)節(jié)[6]。目前，分離環(huán)節(jié)常會(huì)采用顯色培養(yǎng)基，使其菌落顏色不同于其它干擾菌，實(shí)現(xiàn)快速分離。鑒定常采用生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)。目前，生化反應(yīng)的鑒定技術(shù)多采用數(shù)值分類鑒定和自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)主要包括：（1）API Listeria生化鑒定試紙條；（2）全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，如VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)及BIOLOG系統(tǒng)等。雖然該方法結(jié)果互認(rèn)程度高，但操作強(qiáng)度大、檢驗(yàn)周期長，需6～7d，無法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。表3介紹了ISO、USDA、FDA、中國國標(biāo)和行標(biāo)等檢測(cè)方法。

4 李斯特菌快速篩查技術(shù)

傳統(tǒng)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力操作要求高，因此，李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品的開發(fā)是必要的。美國、歐盟等發(fā)達(dá)國家對(duì)微生物快速檢測(cè)方法的研究和產(chǎn)品認(rèn)證體系相對(duì)成熟，各種不同的快檢系統(tǒng)和自動(dòng)化儀器被推出，并得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，李斯特菌快速檢測(cè)方法為增菌以后，生化鑒定之前，對(duì)樣本進(jìn)行快速篩選，以縮小檢測(cè)范圍，減少檢測(cè)任務(wù)，提高檢測(cè)效率?？焖贆z測(cè)方法主要包括酶底物顯色技術(shù)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)三大類。

4.1 即用培養(yǎng)技術(shù)

即用培養(yǎng)基技術(shù)則省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接檢測(cè)樣品，從而節(jié)約了大量人力成本。目前，商業(yè)化的固定培養(yǎng)基技術(shù)主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養(yǎng)基固定于紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計(jì)數(shù)。即用平皿法是指用已倒有培養(yǎng)基的平皿，接種操作與傳統(tǒng)涂板、劃線法一樣。其優(yōu)點(diǎn)和紙片法一樣，即省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接接種培養(yǎng)。

4.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

該技術(shù)以抗原抗體免疫為基礎(chǔ)，制備特異性克隆抗體檢測(cè)細(xì)菌。目前國內(nèi)外李斯特菌快速檢測(cè)的此類技術(shù)主要包括：酶聯(lián)熒光分析法（ELFA）、金標(biāo)免疫層析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)等。ELFA靈敏度比ELISA高，并省去了ELISA中的顏色反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間；但缺點(diǎn)是成本較高，目前主要應(yīng)用在自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)（VIDAS）上[7]。金標(biāo)免疫層析技術(shù)是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上，且可與固相支撐基質(zhì)相分離。當(dāng)檢測(cè)樣品中存在李斯特菌時(shí)，測(cè)試單元的試劑將會(huì)被展開，產(chǎn)生肉眼可見的確定性反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段[6]，它可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)。

4.3 分子學(xué)檢測(cè)方法

分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括核酸探針雜交技術(shù)、PCR檢測(cè)技術(shù)等。DNA探針法是將兩條堿基互補(bǔ)的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交，通過檢測(cè)樣品與標(biāo)記性DNA探針之間形成的雜交分子來檢測(cè)樣品中的單增李斯特菌，測(cè)定放射性或熒光強(qiáng)度即可得出樣品中單增李斯特菌的個(gè)數(shù)[8]。PCR是近年來廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，在單增李斯特菌的檢測(cè)中以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列（常用的靶序列包括hly、actA、prfA等）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。該方法特異性好，但靈敏度低，對(duì)樣品進(jìn)行前處理后再進(jìn)行擴(kuò)增，可以提高檢出率和檢測(cè)靈敏度。PCR技術(shù)還可對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行定量檢測(cè)。國內(nèi)外目前主要應(yīng)用的PCR技術(shù)包括：實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time PCR）、多重PCR、恒溫?cái)U(kuò)增、RT-PCR方法、IMS-PCR檢測(cè)技術(shù)等[9]。

5 小結(jié)

微生物檢測(cè)包括前處理、增菌、富集、檢測(cè)等環(huán)節(jié)。為實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)食品微生物，每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)有相應(yīng)的篩查技術(shù)及產(chǎn)品。微生物快速檢測(cè)今后的發(fā)展趨勢(shì)主要是免疫學(xué)方法和核酸方法，分子檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏、高特異、快速等特點(diǎn)，在近幾十年得到快速發(fā)展與應(yīng)用，但相關(guān)技術(shù)還應(yīng)向標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)品化方向發(fā)展，且開發(fā)更適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查技術(shù)與設(shè)備。免疫技術(shù)以高特異、快速特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。我國在微生物快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及技術(shù)研發(fā)方面相對(duì)歐洲國家比較落后，快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用需要政府相關(guān)機(jī)構(gòu)、科研單位、企業(yè)共同的努力建立一套快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的檢測(cè)體系，此外，還需要降低檢測(cè)成本，提供檢測(cè)靈敏度和實(shí)用性，這些是今后微生物快速檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

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