丹皮提取物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17細(xì)胞的影響

胡銀娥,代淑芳,王斌,瞿偉

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 皮膚科，河南 開封 475000)

?

丹皮提取物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17細(xì)胞的影響

胡銀娥,代淑芳,王斌,瞿偉

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 皮膚科，河南 開封 475000)

目的 探究丹皮提取物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者Th17細(xì)胞的影響。方法 選擇2012年3月～2013年8月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院接受治療的SLE患者168例，以數(shù)字法隨機法分為對照組和觀察組，每組84例。對照組應(yīng)用常規(guī)藥物治療，觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用丹皮提取物治療。對比2組治療前后Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞百分率，并觀察不良反應(yīng)發(fā)生率。結(jié)果 治療前2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后觀察組Th17細(xì)胞百分率下降至(0.27±0.15)%、Th1細(xì)胞上升至(2.53±1.72)%，均較對照組變化幅度更明顯(P<0.05)。治療后觀察組IL-6水平、SLEDAI評分以及ESR均比對照組下降明顯(P<0.05)。總不良反應(yīng)發(fā)生率也顯著少于對照組(P<0.05)。結(jié)論 丹皮提取物能有效改善SLE患者病情，通過降低Th17細(xì)胞百分比及增加Th1細(xì)胞的百分比發(fā)揮作用，不良反應(yīng)少。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；Th17細(xì)胞；丹皮提取物

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)在臨床上屬于多因素引發(fā)的自身免疫性疾病，因為免疫功能被打亂或者被抑制，導(dǎo)致系統(tǒng)異常[1]。臨床研究認(rèn)為SLE發(fā)病的源頭是T細(xì)胞異常，T細(xì)胞在體現(xiàn)抗原作用的過程中特異性分化為Th1、Th2、Th17與Th1細(xì)胞4種細(xì)胞亞型[2]。研究發(fā)現(xiàn)SLE患者Th17與Th1細(xì)胞百分率異常[3]，因此猜測Th17可能參與SLE的發(fā)病機制。鑒于此，本文旨在通過應(yīng)用丹皮提取物治療SLE,研究Th17水平的變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3月～2013年8月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院接受治療的SLE患者168例。均滿足美國風(fēng)濕病學(xué)會在1997年制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中男性71例，女性97例。年齡37～72歲，平均(41.2±14.3)歲。采用數(shù)字法隨機分為觀察組和對照組,每組各84例。觀察組男性35例，女性49例。年齡37～70歲，平均(41.1±14.2)歲。平均病程(8.56±3.37)月，平均補體C3為(0.46±0.16)g/L，平均ALB為(26.67±6.12)g/L。對照組男性36例，女性48例。年齡38～72歲，平均(41.3±14.4)歲。平均病程(8.49±3.21)月，平均補體C3為(0.48±0.13)g/L,平均ALB為(26.71±6.09)g/L。2組患者在年齡、性別、治療前相關(guān)指標(biāo)等基本資料相仿，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本試驗得到相關(guān)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者及家屬同意且均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：氯喹、羥氯喹，丹皮粉末(西安瀚華生物科技公司)；氟伐他汀(北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20010518)；酶聯(lián)免疫吸附試驗IL-6試劑盒(上海谷研生物科技公司)；RPMI1640(美國Gibco公司)；Th17、Th1抗體、固定液、破膜洗滌液(美國Sigma公司)

1.2.2 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；低溫高速離心機(德國HERAEUS 公司，型號：FRESCO21)；魏氏血沉管、超凈工作臺(中國蘇州，型號：SW-CJ-IFD)；恒溫水浴箱(Selby Scientific and Medical，美國)；不銹鋼滅菌鍋(上海申安醫(yī)療設(shè)備，型號DSX-280A)；Σ960全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國Thermor)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2.3 分組:對照組采用常規(guī)藥物治療(非甾體類抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，常用劑量為氯喹0.25 g，每天1次；羥氯喹0.2～0.4 g，每天分1～2次。部分患者每周服5 d即可。待癥狀控制后，可改為隔天服藥，或每周服2 d維持)，觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用丹皮提取物進(jìn)行治療。丹皮提取物的提取過程：取適量的丹皮粉末于圓底燒瓶后,加入10倍蒸餾水浸泡0.5 h，通過多層紗布過濾。循環(huán)2次后將所有濾液合并，減壓至藥物濃度為5 g/mL備用。觀察組每天以1 g/60 kg的標(biāo)準(zhǔn)服用丹皮提取物，而對照組服用常規(guī)氟伐他汀1 g/60 kg進(jìn)行治療。持續(xù)治療2個月。

1.2.4 觀察指標(biāo) 觀察對比2組Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞的百分率、IL-6水平、血沉(ESR)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度評分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分及不良反應(yīng)發(fā)生率[5]。

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17及Th1細(xì)胞所占的比例，具體步驟如下：①抽取患者空腹血，加入EDTA抗凝，以密度梯度離心法分離提取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；②用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)PBMC；③調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個/mL，取單個核細(xì)胞懸浮液20 μL，加20 μL 1 μg/mLPMA工作液+8 μL 50 μg/mL lonomycin工作液+6.8 μL 0.1 μg/mL Monensin+5 μL PBS工作液,且充分混勻，在5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h；④熒光素標(biāo)記CD3+、CD4+、IL-17、Th17細(xì)胞：取100 μL培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液，置入流式管內(nèi)，每管中加入固定液5 mL，混勻后室溫孵育20 min。加入破膜洗滌液2 mL，混勻后室溫孵育20 min，離心機離心后去上清液，再進(jìn)行破膜洗滌液洗滌與細(xì)胞重懸，加入10 μL抗人Th17 Alex Flour647-CD3FITC-CD4PE抗體(1:1000)震蕩搖勻后，室溫暗處孵育30 min。上流式細(xì)胞儀檢測。Th1細(xì)胞的比例檢測步驟同上。

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中IL-6，取2 mL患者靜脈血，加至抗體包被板條的對應(yīng)小孔中，37 ℃孵箱孵育30 min。洗板，加入生物素化抗體溶液，37 ℃孵箱孵育60 min。洗板，加入酶結(jié)合物溶液，37 ℃孵箱孵育30 min。洗板，加入顯色劑，避光孵育10～15 min；加入終止液，均勻混合后立即測定OD450值。

采用魏氏法對血沉進(jìn)行測定[6]，取靜脈血1.6 mL，置入魏氏血沉管中，按1:4比例加入109 mmol/L枸櫞酸鈉，移入干凈、干燥的血沉管中，調(diào)零后，血沉管在室溫下嚴(yán)格垂直放置1 h后，觀察血漿凹液面底部至沉降紅細(xì)胞柱頂部之間的距離，該距離的數(shù)值即為血沉結(jié)果。

1.2.5 患者不良反應(yīng)評價 應(yīng)用SLEDAI積分來進(jìn)行不良反映評價[7]?？傆?05分，其中<9分表示穩(wěn)定，≥10分為活動。

2 結(jié)果

2.1 治療前后2組Th17細(xì)胞與Th1的百分率比較 治療前2組Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞的百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與治療前比較，治療后2組患者Th17細(xì)胞百分率均下降，Th1細(xì)胞百分率均上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，治療后觀察組Th17細(xì)胞百分率更低，Th1細(xì)胞百分率更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組治療前后Th17細(xì)胞與Th1的百分率比較Tab.1 Comparison of percentage of Th17 cells and Th1 cells before and after treatment of two ±s，%)

#P<0.05，與治療前比較，compared with before treatment；*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

2.2 2組治療前后IL-6水平、SLEDAI評分以及ESR比較 治療前2組IL-6、SLEDAI、ESR指標(biāo)差異標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后觀察組IL-6水平、SLEDAI評分及ESR均比對照組下降更明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 2組治療前后IL-6水平、SLEDAI評分以及ESR水平比較Tab.2 Comparison of levels of IL-6, SLEDAI score and ESR before and after treatment of two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

2.3 2組不良反應(yīng)發(fā)生率比較 2組均出現(xiàn)胃腸道不適、感染以及肝損害等不良反應(yīng)，但觀察組的總不良反應(yīng)數(shù)僅為8.33%(7/84)，顯著小于對照組的21.43%(18/84)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 2組不良反應(yīng)發(fā)生率對比[n(%)]Tab.3 Comparison of adverse reactions of two groups[n(%)]

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

丹皮是指牡丹的根皮，由于根皮富含芍藥苷以及丹皮酚等重要成分而被廣泛應(yīng)用。丹皮對人體有多種調(diào)節(jié)作用，主要是對血管、炎癥的影響[8]。許多研究表明丹皮能增加血流量，對心肌血管有明顯的保護(hù)作用[9-10]，并且丹皮中的丹皮酚有明顯的降壓效果，對動脈粥樣硬化有顯著的緩解作用。研究發(fā)現(xiàn)：丹皮中的芍藥苷以及丹皮酚是通過抑制小鼠血小板的正常凝聚來抵制小鼠粥樣硬化，抑制纖維蛋白溶酶原的活性以達(dá)到抵抗作用[11]。另外，丹皮酚具有明顯的抗菌消炎作用[12-13]，且丹皮中的丹皮酚有明顯的降壓效果，對動脈粥樣硬化有顯著的緩解作用。

本文通過研究丹皮提取物對SLE患者Th17細(xì)胞百分率的影響，發(fā)現(xiàn)治療后觀察組Th17細(xì)胞百分率下降至(0.27±0.15)%、Th1細(xì)胞上升至(2.53±1.72)%，較對照組變化均更明顯(P<0.05)。而IL-6水平、SLEDAI評分以及ESR均比對照組下降明顯(P<0.05)，與馬紀(jì)林等[14]的報道相符。Th17細(xì)胞會產(chǎn)生IL-17，在他們的共同作用下激活蛋白激酶后增強炎癥反應(yīng)[15]。而Th1細(xì)胞主要功能是維持自身免疫力的耐受性，減少自發(fā)性免疫疾病發(fā)生時對系統(tǒng)的影響[16]。研究表明，應(yīng)用丹皮提取物治療SLE后患者免疫功能明顯提高，這是因為丹皮酚對血流速度有提升效果[17]。有研究表明，丹皮對大鼠SLE癥狀緩解主要體現(xiàn)在脾臟質(zhì)量的增加中[18]，由此可見丹皮對SLE的療效顯著。此外，在對治療SLE的不良反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)：觀察組的不良反應(yīng)總比例少于對照組，與許文芳等[19]，趙慧霞等[20]的報道一致。這可能是因為丹皮具有高效抗菌作用，對神經(jīng)系統(tǒng)的緩解影響大。因此能顯著改善病況，減輕病患壓力。

綜上所述，應(yīng)用丹皮提取物治療SLE效果顯著，能通過降低Th17細(xì)胞百分率及升高Th1細(xì)胞的百分率增強患者免疫功能，降低治療后不良反應(yīng)比例。

[1] 王冬柏.清熱利濕解毒方劑用于老年系統(tǒng)性紅斑狼瘡的副作用評價[J].中國生化藥物雜志，2014，35(1)：130-131，134.

[2] Vincze K, Kovats Z, Cseh A,et al.Peripheral CD4+ cell prevalence and pleuropulmonary manifestations in systemic lupus erythematosus patients[J].Respiratory Med,2014,108(5):766-774.

[3] Annunziato F,Cosmi L, Santarlasci V,et a1.Phenotypic and runetionalfeatures of human Th 17 cells[J].J Exp Med,2007,204(8):1849-1861.

[4] Zhao L,Ma H,Jiang Z,et al.Immunoregulation therapy changes the frequency of interleukin (IL)-22+ CD4+T cells in systemic lupus erythematosus patients[J].Clin Exp Immunol,2014,177(1):212-218.

[5] 傅若秋，孟德勝，胡大強，等.牡丹皮水提取物及乙醇提取物的抗菌作用研究[J].中國藥業(yè)，2010，19(18)：29-30.

[6] 姚雙明.自動血沉儀與魏氏法血沉結(jié)果的比對[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2011，15(14)：433-434.

[7] 張洪峰，肖衛(wèi)國，侯平.白芍總苷治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(4)：476-478.

[8] 沈立，杜強，蔡健康.丹皮酚對急性哮喘模型小鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素表達(dá)的影響[J].中國生化藥物雜志，2012，33(6)：762-765.

[9] 林惠旋，曾錦培，白俐，等.丹皮酚對血小板衍性生長因子-BB型所致血管平滑肌細(xì)胞增殖周期的影響[J].嶺南心血管病雜志，2013，19(5)：621-625.

[10] 王桐生，王艷華，吳德玲，等.丹皮不同提取物對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠血液流變學(xué)及細(xì)胞因子的影響[J].中藥材，2012，35(10)：1649-1652.

[11] 王玫，劉繼勇，韓盈，等.丹皮酚對TNF-α誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞MMP-9 mRNA及細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2009，25(4)：458-460.

[12] 江麗，單萍萍，申國慶，等.中藥對痤瘡致病菌的體外抑菌活性實驗研究[J].藥學(xué)與臨床研究2014，22(4)：315-318.

[13] 胡云飛，徐國兵.牡丹皮及其主要成分丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥：2014，18(4)：589-592.

[14] 馬紀(jì)林，劉小賢，汪衛(wèi)，等.初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞的檢測及意義[J].浙江醫(yī)學(xué)，2013，35(4)：1787-1790.

[15] 史衛(wèi)紅，高勝利，宋祥和，等.白介素-18對肝癌裸鼠皮下移植瘤浸潤的CD4+T細(xì)胞子集的影響[J].中國生化藥物雜志，2012，33(5)：578-582.

[16] 馮春蝶，王福玲，袁芳，等.Th17和Treg細(xì)胞在內(nèi)異癥患者外周血中的變化及意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2013，48(8)：631-633.

[17] 馬紀(jì)林，蔡龍，施華萍，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞失衡的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42(3)：27-30.

[18] 蔣震，刁慶春.兩種中藥方劑對SLE患者PBMC凋亡率的影響[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24(7)：663-665.

[19] 許文芳，吳勇，潘國紹，等.芪靈湯聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法對HIV/AIDS患者Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34(2)：157-161.

[20] 趙慧霞，王彩虹，羅靜，等.羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細(xì)胞凋亡及輔助性T細(xì)胞17影響的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2014，18(2)：91-94.

(編校：吳茜)

Effect of moutan cortex extract on Th17 cells of patients with systemic lupus erythematosus

HU Yin-e,DAI Shu-fang,WANG Bin,QU Wei

(Department of Dermatology, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China)

ObjectiveTo study the effect of moutan cortex extract on Th17 cells of systemic lupus erythematosus (SLE) patients, so as to provide reference for clinical practice.MethodsA total of 168 SLE patients admitted to our hospital from March 2012 to August 2013 were selected as subjects, andrandomized into the observation group and control group.84 patients in observation group received moutan cortex extract treatment and 84 patients in control group received conventional medical treatment.The Th17 and Th1 cell percentage of two groups before and after treatment were compared, and the incidence of adverse reactions were observed.ResultsAll the indicators before treatment showed no statistically significant differences between two groups.After treatment, the Th17 cell percentage of observation group decreased to (0.27±0.15)%, and the Th1 cell percentage increased to (2.53±1.72)%, showing more significant changes than control group (P<0.05).The reduction of IL-6 level, SLEDAI score and ESR after treatment were more significant in observation group than in control group(P<0.05).The incidence of adverse reactions was lower in observation group than in control group (P<0.05).ConclusionMoutan cortex extract can effectively improve the condition of SLE through reducing the Th17 cell percentage and increasing Th1 cell percentage with less adverse reactions.

systemiclupus erythematosus;Th17 cells;moutan cortex extract

胡銀娥，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：紅斑鱗屑性皮膚病、結(jié)締組織病、皮膚附屬器疾病及性傳播疾病，E-mail: hye123587@163.com。

R758.62

A

1005-1678(2015)03-0119-03