四種蓮子心生物堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張玉玲,楊光明,李萍,潘揚(yáng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

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四種蓮子心生物堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張玉玲,楊光明,李萍,潘揚(yáng)Δ

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

目的 探討中藥蓮子心中4種生物堿蓮心季銨堿(Lot)、蓮心堿(Lien)、異蓮心堿(Iso)和甲基蓮心堿(Nef)對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304氧化損傷的保護(hù)作用。方法 采用MTT法測(cè)定不同濃度Lot、Lien、Iso和Nef 對(duì)正常和H2O2損傷ECV304細(xì)胞活性的影響，通過(guò)比色法測(cè)定并比較各組細(xì)胞一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的水平。結(jié)果 Lot、Lien、Iso和Nef對(duì)正常ECV304細(xì)胞形態(tài)和活性均無(wú)影響；Lot為100 μmol/L， Lien、Iso和Nef為0.1 μmol/L時(shí)，對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞活性有較好的緩解作用，此時(shí)細(xì)胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。4種生物堿在上述劑量時(shí)對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改善作用與陽(yáng)性藥卡托普利基本相近，除Lot的作用較弱外，Lien、Iso和Nef均可使受損內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞彼此相連增強(qiáng)，細(xì)胞邊界變清晰。另外，且4種蓮子心生物堿均可提高H2O2致傷內(nèi)皮細(xì)胞的NO濃度(P<0.05)，增加損傷內(nèi)皮細(xì)胞的NOS活性(P<0.05)。結(jié)論 蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿均對(duì)H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)增加NOS生成提高血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的功能。

蓮心季銨堿；蓮心堿；異蓮心堿；甲基蓮心堿；血管內(nèi)皮細(xì)胞；H2O2誘導(dǎo)損傷

當(dāng)前我國(guó)心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發(fā)病率在不斷攀升，發(fā)病年齡也有所提前，這種不斷上升趨勢(shì)主要與人們生活水平提高、生活習(xí)慣改變、人口老齡化、環(huán)境不斷變化等導(dǎo)致CVD的危險(xiǎn)因素持續(xù)增長(zhǎng)有關(guān)，已成為我國(guó)當(dāng)今社會(huì)人群健康所面臨的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，加強(qiáng)心血管疾病的防治已刻不容緩。血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血流與平滑肌細(xì)胞之間，其損傷和功能的改變?cè)诙喾NCVD發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，尤其是對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為一氧化氮(NO)等內(nèi)皮依賴(lài)性舒張因子(endothelium derived relaxing factor，EDRF)分泌減少或生物利用度降低，而內(nèi)皮素(endothelin,ET)等內(nèi)皮依賴(lài)性收縮因子(endothelium derived contracting factor，EDCF)分泌增多[1]。氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷是引起血管內(nèi)皮功能障礙的重要原因，它使氧自由基大量產(chǎn)生，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核酸變性，導(dǎo)致內(nèi)皮不可逆損傷；同時(shí)活性氧還參與以?xún)?nèi)皮細(xì)胞脫落為特征的“失巢凋亡”[2]。目前，H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO失衡導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡越來(lái)越受到人們的關(guān)注，因此對(duì)NO水平進(jìn)行調(diào)控有望成為治療氧自由基引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡異常相關(guān)心血管疾病的有效策略。而利用祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥改善細(xì)胞功能、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷是防治CVD的重要手段之一[3]。

蓮子心為常用中藥，來(lái)源于睡蓮科植物睡蓮成熟種子NelumbonuciferaGaertn.的綠色幼葉及胚根，具有清心安神、去熱，交通心腎、澀精止血之功效[4]。蓮子心中異喹啉類(lèi)生物堿是其主要活性成分，其中以蓮心季銨堿(Lot)、蓮心堿(Lien)、異蓮心堿(Iso)和甲基蓮心堿(Nef)為代表[5-6]。在前期研究中，本課題組已獲得了純度較高的這4種生物堿，并對(duì)它們的光(波)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的解析[7-8]。近年來(lái)，很多研究已發(fā)現(xiàn)Nef對(duì)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[9-11]，但至今尚未見(jiàn)對(duì)這4種生物堿保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞作用比較的研究報(bào)道。本文擬采用形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測(cè)定Lot、Lien、Iso和Nef 對(duì)正常和H2O2損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304活性的影響，并通過(guò)比色法測(cè)定各組細(xì)胞一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的水平，以評(píng)估蓮子心4種生物堿對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀(BIORAD，USA)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS bx-50)；CO2培養(yǎng)箱(Forma3111，USA)；Countess全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Invitrogen，USA)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIORAD，USA)；L-650Y超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(上海皓莊儀器有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，均從蓮科植物Nelumbo nucifera Gaertn. 種子的幼葉及胚根分離純化得到，并經(jīng)UV、IR、NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)[5-6]，HPLC面積歸一化法分析，4種生物堿純度均大于95%。4種生物堿均用DMSO溶解配成高濃度的母液備用。

RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO，P1520)；小牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，上海伯奧生物科技公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司)；次黃嘌呤[Hypoxanthine，SIGMA(Cell Culture Tested)，086K06621]；黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，IGMA，024K37841)；NO及NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；卡托普利(Captopril，F(xiàn)luka)。

1.1.3 細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株ECV304(中科院上海生化細(xì)胞研究所，由本校王明艷教授傳代并惠贈(zèng))，按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)[12]。

1.2 細(xì)胞懸液的制備 常規(guī)方法復(fù)蘇凍存的ECV304細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶液消化成細(xì)胞懸液，PBS緩沖液洗2～3遍，換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻，即得細(xì)胞懸液。

1.3 H2O2體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷 取上述細(xì)胞懸液，使終濃度約為1×105個(gè)/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，每孔加入不同濃度H2O2和生理鹽水各10 μL，使H2O2終濃度分別為0，0.1，0.2，0.4，1，2和4 mmol/L，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，每孔加入50 μL 10 mg /mL MTT溶液，孵育4 h，傾去上清，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀上于490 nm處測(cè)定OD值，按下式計(jì)算各組增值抑制率。

1.4 4種生物堿對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞活性的作用 取細(xì)胞懸液，按上法操作，實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)，不加藥物；②陽(yáng)性對(duì)照組：加卡托普利(Cap)使終濃度為10 μmol/L；③給藥組：Lot組、Lien組、Iso組、Nef組，每個(gè)藥物分別設(shè)4個(gè)終濃度：100、10、1、0.1 μmol/L。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，MTT法測(cè)定各孔的OD值。

1.5 不同濃度的4種生物堿對(duì)H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 取細(xì)胞懸液，按上法操作，實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)，不加藥物及H2O2；②模型(H2O2)組：僅加H2O2；③陽(yáng)性對(duì)照組：Cap(終濃度為10 μmol/L)+H2O2；④給藥組：Lot組(Lot+H2O2)、Lien組(Lien+H2O2)、Iso組(Iso+H2O2)、Nef組(Nef+H2O2)，每個(gè)藥物分別設(shè)4個(gè)終濃度：100、10、1、0.1 μmol/L。H2O2造模終濃度根據(jù)“1.1.3”項(xiàng)下結(jié)果來(lái)確定。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，MTT法測(cè)定各組OD值。

1.7 NOS活性的測(cè)定 本法的原理在于NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS活性。按照“1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，按NOS試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，530 nm波長(zhǎng)、0.5 cm光徑，比色，并按下式計(jì)算各組細(xì)胞NOS活性。

(消光系數(shù)ε：L/nmol；體積：mL；光徑：cm；反應(yīng)時(shí)間：min)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件的One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析及均值多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞濃度的確定 在倒置相差顯微鏡下觀察：空白對(duì)照組與0.1 mmol/L H2O2損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)上基本無(wú)差別，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼壁較牢，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞呈多角形或短梭形，邊界清楚，大小均勻。0.2、0.4 mmol/L H2O2損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)收縮、變圓，胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，部分細(xì)胞脫落現(xiàn)象。1、2、4 mmol/L H2O2損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞則出現(xiàn)胞膜邊緣不清晰，部分胞膜不完整，甚至損傷破裂，有較多細(xì)胞脫落，并形成大片脫失區(qū)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(×200)A.空白對(duì)照；B. 0.1 mmol/L H2O2；C. 0.2 mmol/L H2O2；D. 0.4 mmol/L H2O2Fig.1 Different concentrations of H2O2-induced damage morphology of endothelial cells (×200)A.control group; B. 0.1 mmol/L H2O2 group; C. 0.2 mmol/L H2O2 group;D.0.4 mmol/L H2O2 group (×200)

MTT法測(cè)定結(jié)果表明：與空白對(duì)照組相比，除0.1 mmol/L H2O2組OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各濃度損傷組OD值均顯著降低(P<0.05或0.01)。H2O2濃度與對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，H2O2濃度大，抑制作用越大。0.4 mmol/L即可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P<0.01)。綜合上述形態(tài)學(xué)的觀察，本實(shí)驗(yàn)以終濃度為0.4 mmol/L的H2O2作為模型組，其抑制率約為35%左右。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞MTT測(cè)定(n=4)Tab. 1 Different concentrations of H2O2-induced damage of endothelial cells MTT assay(n=4)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對(duì)照相比, compared with control group

2.2 4種生物堿對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 MTT法測(cè)定表明：與空白對(duì)照相比，陽(yáng)性對(duì)照(Cap，10 μmol/L))、給藥組(Lot，Lien，Iso和Nef)各劑量(0.1～100 μmol/L)的OD值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示與陽(yáng)性藥物一樣，Lot、Lien、ISO和Nef對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯的毒性。見(jiàn)表2。

表2 4種生物堿對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(n=4)Tab.2 Effects of four alkaloids on normal endothelial cell activity(n=4)

2.3 不同濃度的4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 MTT法測(cè)定表明：4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用的最低濃度各不相同，Lien+H2O2組和Iso+H2O2組0.1 μmol/L、Nef+H2O2組10 μmol/L及Lot+H2O2組100 μmol/L的OD值均顯著高于模型組(P<0.05或0.01)。除Lot外，Lien、Iso和Nef均隨著劑量的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用也不斷增大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)：3者濃度高于100 μmol/L時(shí)，藥物顯示的是抑制受損細(xì)胞增殖的作用，因此本實(shí)驗(yàn)采用Lot為100 μmol/L，Lien、Iso和Nef均為0.1 μmol/L的藥物劑量為治療劑量進(jìn)行以下研究，此時(shí)細(xì)胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、1129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度的4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響(n=4)Tab.3 Four different concentrations of H2O2-induced damage alkaloids on the proliferation of endothelial cells(n=4)

**P<0.01，與空白對(duì)照相比，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.4 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置相差顯微鏡下觀察：與空白對(duì)照相比，陽(yáng)性藥物Cap+H2O2組血管內(nèi)皮細(xì)胞與之形態(tài)相似，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼壁較牢，連接緊密，邊界清楚，呈多角形或短梭形，部分變圓，大小均勻。4種生物堿在治療劑量時(shí)對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改善作用與陽(yáng)性藥物基本相近，除Lot的作用稍差外，Lien、Iso和Nef均可使受損內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞彼此相連增強(qiáng)，細(xì)胞邊界變清晰。見(jiàn)圖2。

圖2 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)A. 模型組；B. Cap+H2O2；C. Lot+H2O2；D. Lien+H2O2；E. Iso+H2O2；F. Nef+H2O2Fig.2 Four alkaloids on H2O2-induced loss of endothelial cell morphology(×200)B. Model group; B. Cap+H2O2 group；C. Lot+H2O2 group；D. Lien+H2O2 group；E. Iso+H2O2 group；F. Nef+H2O2 group

2.5 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的影響 結(jié)果表明：與空白對(duì)照組(52.82 μmol/L)相比，模型組NO濃度(29.35 μmol/L)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明H2O2誘損內(nèi)皮細(xì)胞模型已具備。與模型組相比，4種生物堿除Lot的NO濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，Lien(51.45 μmol/L)、Iso(44.83 μmol/L)和Neo(53.99 μmol/L)與陽(yáng)性對(duì)照Cap(52.44 μmol/L)一樣，NO濃度均顯著提高(P<0.05)。Lien、Iso和Neo與陽(yáng)性對(duì)照組相比，NO濃度的提升并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3種蓮子心生物堿之間NO濃度也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但以Nef的最高。見(jiàn)圖3。

圖3 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度的影響(n=4)*P<0.05，與空白對(duì)照相比；#P<0.05，與模型組相比Fig.3 Effects of four alkaloids on H2O2-induced loss of endothelial NO concentration cells(n=4)*P<0.05，compared with blank group; #P<0.05，compared with model group

2.6 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞NOS水平的影響 結(jié)果表明：與空白對(duì)照組(8.25 μmol/L)相比，模型組NOS活性(5.57 μmol/L)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明H2O2誘損內(nèi)皮細(xì)胞模型已具備。與模型組相比，4種生物堿Lot(7.84 μmol/L)、Lien(8.12 μmol/L)、Iso(8.16 μmol/L)和Neo(8.24 μmol/L)與陽(yáng)性對(duì)照Cap(8.10 μmol/L)一樣，NOS活性均顯著提高(P<0.05)。4種蓮子心生物堿與陽(yáng)性對(duì)照組相比，NOS活性的提升差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種蓮子心生物堿之間NOS活性差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但以L(fǎng)ot的最低。見(jiàn)圖4。

圖4 4種生物堿對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性的影響(n=4)*P<0.05，與空白對(duì)照相比；#P<0.05，與模型組相比Fig.4 Four alkaloids on H2O2-induced endothelial cell damage NOS activity(n=4)*P<0.05，compared with blank group; #P<0.05，compared with model group

3 討論

由于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的原代培養(yǎng)有難度，因此失去體內(nèi)原代細(xì)胞的一些特點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞株應(yīng)運(yùn)而生。ECV304細(xì)胞是較為經(jīng)典的人臍靜脈內(nèi)皮自發(fā)轉(zhuǎn)化形成的細(xì)胞系，盡管先前有學(xué)者對(duì)其能否替代HUVEC提出疑問(wèn)[13]，但它仍被作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的模型在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用[14]。最近有學(xué)者還建立了nanoLC-ESI/MS/MS對(duì)ECV304細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法并對(duì)其進(jìn)行了初步的分析，為內(nèi)皮損傷機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[15]。

H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，是一種活性氧，同時(shí)H2O2很易穿透細(xì)胞膜到達(dá)胞內(nèi)位點(diǎn)，因此積累到一定程度會(huì)造成細(xì)胞損傷，但H2O2產(chǎn)生過(guò)多或暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成內(nèi)皮細(xì)胞不可逆損傷。綜合MTT測(cè)定和形態(tài)學(xué)的觀察，本實(shí)驗(yàn)以終濃度為0.4 mmol/L的H2O2作為模型組，從形態(tài)學(xué)上看雖然內(nèi)皮細(xì)胞收縮、變圓，胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，但細(xì)胞邊界尚清楚，形狀亦有一定規(guī)則，細(xì)胞彼此仍然相連，部分細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，說(shuō)明僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)壞死、死亡，其各項(xiàng)指標(biāo)與正常狀態(tài)已有區(qū)別，同時(shí)其抑制率約為35%，此時(shí)施加保護(hù)因子來(lái)抑制細(xì)胞損傷最佳。

形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測(cè)定結(jié)果表明，Lot、Lien、ISO和Nef對(duì)正常ECV304的細(xì)胞形態(tài)和活性均無(wú)影響；Lot為100 μmol/L，以及Lien、Iso和Nef均為0.1 μmol/L時(shí)，對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞活性有較好的緩解作用，此時(shí)細(xì)胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。4種生物堿在上述劑量時(shí)對(duì)H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改善作用與陽(yáng)性藥卡托普利基本相近，除Lot的作用稍差外，Lien、Iso和Nef均可使受損內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞彼此相連增強(qiáng)，細(xì)胞邊界變清晰。比色法測(cè)定結(jié)果還表明，Lien、ISO和Nef均可提高H2O2致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞的NO濃度(P<0.05)；且這4種蓮子心生物堿均可增加損傷內(nèi)皮細(xì)胞的NOS活性(P<0.05)。

綜上所述，蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿(特別是后3者)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)增加NOS生成提高血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的功能。

[1] Schmieder RE.Endothelial dysfunction:how can one intervene at the beginning of the cardiovascular continuum?[J].J Hypertens Suppl,2006,24 (2):S31-35.

[2] Callaghan MJ,Ceradini DJ,Gurtner GC.Hyperglycemiainduced reactive oxygen species and impaired endothelial progenitor cell function[J].Antioxid Redox Signal,2005,7 (11-12):1476-1482.

[3] 曲政軍，李運(yùn)倫. 中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(3)：320-323.

[4] 李娟，夏延斌. 蓮子心生物堿保健功能研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2010，1:40-43.

[5] 張弦，潘揚(yáng). 植物蓮中生物堿類(lèi)成分的研究概況[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，18(6)：382-384.

[6] 張京梅，李鵬躍，王嵐，等.蓮子心總生物堿的提取分離及藥效學(xué)初步研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(6)：26-28.

[7] 潘揚(yáng)，楊光明，蔡寶昌，等.蓮心季銨堿的結(jié)構(gòu)解析與鑒定[J].中草藥，2004，35(5)：501-03.

[8] 潘揚(yáng)，楊光明，蔡寶昌. 核磁共振譜分析蓮子心中酚性生物堿的結(jié)構(gòu)[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，21(6)：371-373.

[9] 吳遠(yuǎn)明，賈菊芳，李勇軍，等. 甲基蓮心堿對(duì)氧自由基損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)，1997，11(1)：27-30.

[10] 張賽丹，彭振宇，劉韶，等. 甲基蓮心堿對(duì)LPC誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及與ADMA的關(guān)系[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(21)：2526-2529.

[11] 李桂林，梁尚棟. 甲基蓮心堿對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞和交感神經(jīng)節(jié)損傷的作用及機(jī)理研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2011.

[12] 趙翔，張沙，肖軍軍，等. RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中肝癌細(xì)胞系BEL-7402與HepG-2的生長(zhǎng)狀態(tài)比較[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(11)：2002-2005.

[13] Suda K,Rothen-Rutishauser B,Gunthert M,et al.Phenotypic characterization of human umbilical vein endothelial (ECV304) and urinary carcinoma (T24) cells:endothelial versus epithelial features[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2001,37 (8):5055-5014.

[14] 吳其夏，邱勁.ECV304細(xì)胞可作為一般模型、工具或靶用于生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2004,20 (1):139-142.

[15] 李菊玲，曾耀英，季煜華，等. nanoLC-ESI/MS/MS在ECV304細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)[J].中國(guó)病理生理雜志，2009，25(1)：205-208.

(編校：吳茜)

Protective effects of four alkaloids of embryo loti on H2O2-induced oxidative damage of vascular endothelial cells

ZHANG Yu-ling,YANG Guang-ming,LI Ping, PAN YangΔ

(School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

ObjectiveTo observe protective effects of four active liposoluble alkaloids of a Chinese herb, lotusine (Lot), liensinine (Lien), isoliensinine (Iso) and neferine (Nef) of embryo loti (the green embryo), against H2O2-induced oxidative damage on human umbilical vascular endothelial cell ECV-304.MethodsThe protective effects of Lot, Lien, Iso and Nef on the survival of normal and oxidatively damaged ECV 304 cells were studied by cell morphology observation and 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium (MTT) assay. The levels of nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) were measured using colorimetric assay.ResultsLot, Lien, Iso and Nef did not affect cell morphology and cell viability of normal ECV 304 cells. The survival of oxidative damaged vascular endothelial cells was rescued by incubating with Lot at 100 μmol/L, and Lien, Iso and Nef at 0.1 μmol/L. The proliferative activity of medicated groups increased to 112.8%, 129.3%, 125.6 and 118.2%, respectively (P<0.01 or 0.05), relative to that of the group with H2O2induced oxidative damage. The four alkaloids restrained oxidative injury of endothelial cells induced by H2O2and the protective influences were similar with captopril, which served as a positive control. Each alkaloid except Lot reduced intercellular space and increased the connections of oxidative damaged cells, concomitant with more recognizable cell borders. Lien, Iso and Nef also increased the concentration of NO (P<0.05). Besides, all of the four alkaloids activated NOS in damaged vascular endothelial cells (P<0.05).ConclusionThe four alkaloids of embryo loti, especially Lien, Iso and Nef, have certain protective effects against H2O2-induced oxidative damage on vascular endothelial cells. The protective mechanism may be promotion of NO release through the increase of NOS production.

lotusine; liensinine; isoliensinine; neferine; vascular endothelial cells; H2O2-induced oxidative damage

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373295)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2014)

張玉玲，女，碩士在讀，研究方向：中藥化學(xué)與生物技術(shù)研究，E-mail：95794608@qq.com；潘揚(yáng)，通訊作者，男，博士、研究員、博士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥及中藥作用機(jī)理，E-mail：y.pan2006@163.com。

R932

A

1005-1678(2015)03-0001-05