含笑花藥發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)研究

包 晗，何彤慧

（1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，銀川750021；2 寧夏大學(xué) 西部生態(tài)與生物資源開發(fā)聯(lián)合研究中心，銀川750021）

被子植物的花藥結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組成花藥壁的表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層4層體細胞相互緊鄰，但形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能大不相同。藥室中的花粉發(fā)育也是經(jīng)歷了特殊的細胞分裂和分化方式最后形成了由3個細胞組成的雄配子體?；ㄋ幍陌l(fā)育程序受到嚴格的調(diào)控，通過許多不同于體細胞發(fā)育的方式最終成熟。被子植物的種類很多，花藥的發(fā)育方式也有所不同。至今為止還有很多植物花藥的發(fā)育特征不清楚。含笑（Micheliafigo）屬于木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Michelia），為常綠喬木或灌木，葉革質(zhì)，聚合蓇葖果穗狀。大多數(shù)種類花芳香襲人，樹形優(yōu)美，是可提取精油及綠化、美化環(huán)境和庭園觀賞的重要樹種［1］。在被子植物中，含笑屬是比較原始的類型，但在木蘭科中又是較為進化的分類群。敖成齊［2］對含笑的花粉發(fā)育做了初步觀察，描述了含笑的花藥壁組成特征和小孢子發(fā)生類型。我們對含笑花藥進行了組織化學(xué)研究，揭示了該花藥發(fā)育中營養(yǎng)物質(zhì)積累特征，也發(fā)現(xiàn)有些與其他被子植物不同的現(xiàn)象［3］。鑒于含笑的系統(tǒng)發(fā)育位置和其花藥發(fā)育的特征，值得對其花藥發(fā)育進行深入研究。本試驗通過對含笑花藥發(fā)育中的超微結(jié)構(gòu)變化進行觀察，為研究木蘭科植物胚胎學(xué)發(fā)育機理提供原始資料。

1 材料和方法

含笑采自廈門大學(xué)校園內(nèi)。分別取不同發(fā)育時期的花藥，迅速投入到含2．5%戊二醛、50mmol·L－1二甲胂酸鈉（pH 7．0）緩沖液配制的前固定液中，室溫下前固定3h。之后用相同緩沖液換洗3次，每次30min。清洗后的花藥轉(zhuǎn)入用50mmol·L－1二甲胂酸鈉（pH 7．0）、1%鋨酸配制的后固定液中，在4℃下固定過夜。第二天早晨用相同緩沖液換洗3 次，每次30 min。然后用梯度系列丙酮脫水，Spurr樹脂包埋。包埋的花藥用Leica Ultracut R 型切片機切成約為70～80nm 厚的切片，將切片撈在噴碳具膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后用醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙重染色。使用JEM－2100HC 電子顯微鏡觀察，拍照。

2 觀察結(jié)果

含笑的花呈現(xiàn)出典型的原始花形態(tài)：每朵花中央是數(shù)十個離生心皮組成的雌蕊，其周圍有數(shù)十個花藥。但其花藥的形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育進化的被子植物花藥沒有明顯區(qū)別。在花藥的橫切面上，可看出花藥由藥壁和藥室組成，花藥壁從外向內(nèi)，依次分化出表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層四類細胞結(jié)構(gòu)，藥室中部是花粉發(fā)育的部位（圖版Ⅰ，1）。

2．1 造孢細胞時期

雄蕊原基形成后，在其中部形成一些體積較大的細胞，為次生造孢細胞。次生造胞細呈多邊形，細胞壁較薄，有明顯的核，位于細胞中央（圖版Ⅰ，2），核內(nèi)的染色質(zhì)呈彌散絲狀。此時的絨氈層細胞形態(tài)較規(guī)則，橫切面呈方形。有些絨氈層細胞面向藥室的內(nèi)切向壁與細胞質(zhì)分開，形成一透明區(qū)域。在絨氈層細胞質(zhì)內(nèi)分散著較多的小液泡（圖版Ⅰ，3）。

2．2 母細胞時期

從造孢細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾℃咦幽讣毎袃蓚€明顯的特征，細胞之間出現(xiàn)較大間隙并且在小孢子母細胞的表面形成一層較厚的胼胝質(zhì)壁。在早期小孢子母細胞的細胞質(zhì)內(nèi)有豐富細胞器和小液泡，線粒體和質(zhì)體的體積都較小，內(nèi)部分化程度也較低（圖版Ⅰ，4）。隨著小孢子母細胞的發(fā)育，外表的胼胝質(zhì)壁不斷增厚，小孢子母細胞原有的纖維素壁降解、消失（圖版Ⅰ，5）。有時在纖維素壁降解部位可看到電子密度較低、類似液泡的區(qū)域（圖版Ⅰ，6）。此時，絨氈層細胞的內(nèi)切向壁開始降解，其質(zhì)膜與細胞壁之間形成一層電子密度較低的區(qū)域；兩個絨氈層細胞之間的徑向壁也開始部分分開，呈現(xiàn)比較疏松的狀態(tài)。絨氈層細胞質(zhì)的電子密度較以前增大，細胞質(zhì)中形成了很多小液泡，其中有一些絮狀物質(zhì)（圖版Ⅰ，7）。

2．3 四分體時期

小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分體，四分體小孢子的表面都被厚厚的胼胝質(zhì)壁包裹。胼胝質(zhì)中間有一電子密度較高的薄層（圖版Ⅰ，8）。四分體小孢子內(nèi)有較多的片層膜結(jié)構(gòu)，其中有些是標志合成細胞內(nèi)蛋白的多聚核糖體。線粒體體積較小，內(nèi)部的嵴不明顯，顯示出分化程度較低（圖版Ⅱ，1）。絨氈層細胞的細胞質(zhì)依然濃厚，有較多質(zhì)體和線粒體。內(nèi)切向壁的透明區(qū)域仍保留，在內(nèi)表面上形成了電子密度較高的圓形顆粒，很可能是前烏氏體（圖版Ⅱ，2）。

2．4 小孢子早期

當四分體小孢子的胼胝質(zhì)壁變薄溶解后，小孢子從中釋放出來。有時游離小孢子細胞核中出現(xiàn)兩個核仁。游離小孢子表面的花粉外壁已形成，由明顯區(qū)分的3層結(jié)構(gòu)組成（圖版Ⅱ，3）。小孢子細胞質(zhì)濃厚，有豐富的細胞器，其中線粒體的體積較大，質(zhì)體的體積較?。▓D版Ⅱ，4）。絨氈層細胞的內(nèi)切向壁完全消失，只有1層不規(guī)則的細胞質(zhì)膜。在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，有一些將被分泌到藥室中的原烏氏體，其內(nèi)部的電子密度較低，外部的電子密度較高，與花粉外壁的電子密度相似（圖版Ⅱ，5）。在小孢子形成花粉外壁時，有一電子密度很低的特定部位，扁平的液泡位于花粉壁和細胞質(zhì)膜之間。這個部位的花粉外壁是不連續(xù)的，是將形成花粉萌發(fā)孔的部位（圖版Ⅱ，6）。

2．5 小孢子晚期

被子植物發(fā)育小孢子中無論是否形成大液泡，總是呈現(xiàn)出細胞核靠邊分布的特征，呈現(xiàn)出極性分布，這將為小孢子的不等分裂、開始配子體發(fā)育作準備。最初在單核中位小孢子中形成了許多小液泡。在細胞質(zhì)中有較多的線粒體、質(zhì)體及自體吞噬泡（圖版Ⅱ，7）。隨著小液泡數(shù)量的增加，小液泡融合形成大液泡，細胞核和細胞質(zhì)被擠到細胞的邊緣區(qū)域（通常所說的單核靠邊期），小孢子細胞呈現(xiàn)明顯的極性。小孢子中大液泡的形成為小孢子發(fā)育晚期的特征。這時花粉外壁結(jié)構(gòu)清晰，表層的覆蓋層和基部的基足層已完全形成，中間是連接覆蓋層和基足層的基粒棒層。雖然此時的花粉內(nèi)壁還沒有形成，但在花粉外壁與質(zhì)膜之間有一層電子密度較低的區(qū)域（圖版Ⅱ，8）。在小孢子晚期，絨氈層細胞中的基質(zhì)物質(zhì)減少，電子密度降低，但細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)仍完整。在面向藥室的內(nèi)切向面上仍有一些烏氏體，有些已經(jīng)脫離絨氈層表面，遷移到藥室中（圖版Ⅲ，1）。

2．6 二胞早期

小孢子經(jīng)過一次不等有絲分裂后，形成了大小不等的兩個細胞，進入二胞花粉時期。小的為生殖細胞，其細胞核大，細胞質(zhì)的比例較少，呈透鏡狀緊貼著花粉內(nèi)壁；大的為營養(yǎng)細胞，繼承了原小孢子的絕大部分內(nèi)含物。在剛形成的二胞花粉中，兩個細胞除了細胞核的大小有所差異外，細胞質(zhì)的差異很?。▓D版Ⅲ，2）。以后營養(yǎng)核率先遷移到細胞中央。在營養(yǎng)細胞質(zhì)內(nèi)又重新出現(xiàn)較多的質(zhì)體和線粒體（圖版Ⅲ，3）。這時花粉內(nèi)壁已經(jīng)形成，與花粉外壁的厚度相近，但電子密度較低且由外向內(nèi)降低（圖版Ⅲ，4）。二胞花粉早期時的絨氈層細胞已明顯退化，細胞質(zhì)基質(zhì)的電子密度進一步減小，膜狀結(jié)構(gòu)也明顯減少，細胞器結(jié)構(gòu)模糊。在絨氈層的內(nèi)表面上仍有一些烏氏體（圖版Ⅲ，5）。

2．7 成熟時期

到開花時，花粉發(fā)育成熟。成熟花粉的外壁形成電子密度較高的3層結(jié)構(gòu)，最外層為覆蓋層，中間為基粒棒層，底部為基足層。細胞質(zhì)內(nèi)有一大液泡，內(nèi)部有脂滴分布（圖版Ⅲ，6）。在細胞質(zhì)中有一些淀粉粒和脂滴，但淀粉粒較少（圖版Ⅲ，7）。原來在絨氈層的位置形成了絨氈層膜，緊貼中層。其中還有一些烏氏體結(jié)構(gòu)（圖版Ⅲ，8）。

3 討 論

3．1 液泡的變化

液泡是植物細胞內(nèi)一種特殊的細胞器，也是細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的重要組成部分。在植物細胞的生命活動中，液泡發(fā)揮著多種重要的生理功能：參與并調(diào)節(jié)細胞新陳代謝；控制多種細胞物質(zhì)的合成、積累和運輸；維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；緩沖外界環(huán)境對植物生長發(fā)育的影響；提高物種適應(yīng)環(huán)境變化和生存能力；在細胞遺傳信息的調(diào)控下發(fā)生和發(fā)展，代表著植物細胞結(jié)構(gòu)與功能的轉(zhuǎn)變［4－6］。

液泡的功能多樣，在不同的時間和空間出現(xiàn)的液泡具有不同的功能。在含笑花粉發(fā)育中，細胞內(nèi)的液泡發(fā)生了三次比較明顯的變化。第一次是在小孢子母細胞形成胼胝質(zhì)壁的過程中，可能與胼胝質(zhì)壁的形成有關(guān)。小孢子母細胞合成胼胝質(zhì)并用分泌小泡轉(zhuǎn)移至細胞壁外，形成胼胝質(zhì)壁。第二次是在小孢子母細胞減數(shù)分裂之前，原小孢子母細胞的纖維素壁降解，在降解區(qū)域形成電子密度較低的液泡，推測是小孢子母細胞分泌的纖維素酶將纖維素細胞壁降解的過程。第三次是在晚期小孢子中形成大液泡將細胞質(zhì)擠到邊緣，使細胞產(chǎn)生極性，這將為小孢子的不等分裂做準備，使小孢子進入雄配子體發(fā)育。其結(jié)果是小孢子不等分裂形成一個大的營養(yǎng)細胞和一個小的生殖細胞。細胞核的位移是小孢子不對稱分裂的前提條件之一，保證了不對稱分裂的正常進行［7－8］。小孢子中央大液泡對其未來不對稱性質(zhì)的分裂以及兩個細胞的不同命運起了重要決定作用。通常單核靠邊期的小孢子核位于萌發(fā)孔的對面，而大液泡將細胞核擠到細胞邊緣應(yīng)是隨機分布。有實驗證明微管對于小孢子核的定位有重要作用［9－10］。在小孢子發(fā)育中，大液泡將細胞核擠到細胞邊緣，而細胞骨架則將細胞核定位在萌發(fā)孔對面的位置，共同作用創(chuàng)建了單核靠邊的晚期小孢子結(jié)構(gòu)。然而，目前對小孢子中的大液泡形成過程很少有報道。

3．2 花粉壁的形成

成熟花粉壁包括內(nèi)壁和外壁。外壁由孢粉素構(gòu)成，分為外壁外層和外壁內(nèi)層。外壁外層主要由基柱（pilum）組成，基柱包括頭部和棒兩部分。如果基柱頭部合并，即在基柱上形成1層覆蓋層（tectum），棒是分開的。通常外壁可分為2種類型：具覆蓋層外壁（tectate type）和具基柱外壁（pilate type）。具覆蓋層外壁包含覆蓋層、基粒棒層和外壁內(nèi)層或基足層?；屯獗谠诨g有空隙通向外部［11］?；ǚ蹆?nèi)壁主要為多糖性質(zhì)的纖維素組成。

在不同植物中，花粉內(nèi)外壁的結(jié)構(gòu)和組成成分不同?；ǚ郾诘亩鄻有圆粌H表現(xiàn)在其表面雕紋差異，還表現(xiàn)在發(fā)生過程上［11］。在Platanusacerifolia中，胼胝質(zhì)壁在花粉外壁的構(gòu)建和后來外壁的沉積具有積極的作用［12］。在含笑花粉發(fā)育中，四分體時期的絨氈層細胞就有烏氏體向藥室中分泌。四分體小孢子釋放后，絨氈層細胞表面的烏氏體大量出現(xiàn)，可觀察到烏氏體向藥室內(nèi)遷移，烏氏體內(nèi)含有孢粉素物質(zhì)，可能用于構(gòu)建花粉外壁。隨著花粉發(fā)育，花粉外壁結(jié)構(gòu)在二胞早期完成，而花粉內(nèi)壁在二胞花粉時才開始構(gòu)建。

木蘭科是最原始的被子植物類群之一，花粉形態(tài)亦表現(xiàn)出其原始性。含笑外壁超微結(jié)構(gòu)有覆蓋層，基粒棒層和外壁內(nèi)層或基足層的分化，基粒棒層有小柱形成，但不典型，很少直立小柱，一般小柱傾斜或懸掛在覆蓋層的表面，是為顆粒－初生柱狀層。但外壁內(nèi)層較薄，內(nèi)壁加厚。Walker曾指出被子植物花粉外壁結(jié)構(gòu)的演化趨勢是從無結(jié)構(gòu)層→顆?！跎鶢顚印采w層柱狀層［13］。含笑花粉壁比起木蘭屬有些種類花粉外壁為無結(jié)構(gòu)層，內(nèi)具小裂隙或大小不等的小腔穴，不形成小柱，屬于進化類群。但是比起鵝掌楸，單性木蘭有小柱典型，短而直立，直徑很小的類群，又相對原始［14－15］。這些特征表明木蘭科含笑屬植物外壁結(jié)構(gòu)的多樣性和原始性。

圖版Ⅰ 含笑花藥發(fā)育超微結(jié)構(gòu)PlateⅠ Ultrastructural changes in pollen development of M．figo

圖版Ⅱ T．絨氈層；v．液泡；m．線粒體；p．質(zhì)體；n．細胞核；ub．烏氏體；s．復(fù)合淀粉粒PlateⅡ T．Tapetum；v．Vacuole；m．Mitochondria；p．Plasmid；n．Nucleus；ub．Ubisch body；s．Compound starch grains

圖版Ⅲ T．絨氈層；gc．生殖細胞；vn．營養(yǎng)細胞核；p．質(zhì)體；m．線粒體；ub．烏氏體；s．淀粉粒；v．液泡PlateⅢ T．Tapetum；gc．Generative cell；vn．Vegetative nucleus；p．Plasmid；m．Mitochondria；ub．Ubisch body；s．Starch grain；v．Vacuole

［1］ZHANG X H（張新華）．Advances in research ofMicheliaLinn［J］．Guihaia（廣西植物），2007，27（5）：712－719（in Chinese）．

［2］AO CH Q（熬成齊）．Microsporogenesis，development of male gametophyte inMicheliafigoand their systematic significance［J］．Guihaia（廣西植物），2007，27（6）：836－839（in Chinese）．

［3］BAO H（包 晗），F(xiàn)U SH（傅 劭）．Histochemical observation of polysaccharides and lipids on the developing anthers ofMicheliafigo［J］．ActaBot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物學(xué)報），2013，33（10）：1 981－1 982（in Chinese）．

［4］LIANG X R（廖祥儒），CHEN T（陳 彤），LIU X L（劉小麗）．Formation and function of vacuoles［J］．ChineseJournalofCellBiology（細胞生物學(xué)雜志），2002，24（2）：95－101（in Chinese）．

［5］WANG L J（汪良駒），LIU Y L（劉友良）．Vacules of pant cells and their physiological functions［J］．PlantPhysiologyCommunication（植物生理學(xué)通訊），1998，34（5）：394－400（in Chinese）．

［6］WANG W（王 瑋）．The plant vacuole［J］．JournalofBiology（生物學(xué)雜志），1994，6：9－10（in Chinese）．

［7］TWELL D．Mechanisms of microspore polarity and differential cell fate determination in developing pollen［M］／／CRESTI M，CAI G，MOSCATELLI A．Fertilization in Higher Plants．Berlin Heidelberg：Springer－Verlag，1999：201－215．

［8］PERIASAMY K，SWANY B G L．Morphology of the tapetum in angiosperms［J］．Curr．Sci．，1966，35：427－430．

［9］TERASAKA O，NIITSU T．Unequal cell division and chromatin differentiation in pollen grain cells．Ⅱ．Microtubule dynamics associated with the unequal cell division［J］．Bot．Mag．Tokyo，1990，103：133－142．

［10］ZEE S Y，YE X L．Microtubule reorganization during pollen development of rice（OryzasativeL．）［J］．Protoplasma，2000，21：188－201．

［11］胡適宜．被子植物生殖生物學(xué)［M］．北京：高等教育出版社，2005：29－92．

［12］MARIA S C，JESUS M，JUAN S C．Pollen grain and ubisch body development inPlatanusacerifolia［J］．ReviewofPalaeobotanyand Palynology，1995，85：63－84．

［13］WALKER J W．Evolution of exine struture in pollen of premitive angiosperms［J］．Amer．J．Bot．，1974，61：891－902．

［14］WEI ZH X（韋仲新），WU ZH Y（吳征鎰）．Pollen ultrastructure of liriodendron and its systematic significance［J］．ActaBotanicaYunnanica（云南植物研究），1993，15（2）：163－166（in Chinese）．．

［15］XI Y ZH（席以珍），ZHANG Y L（張玉龍），LIN Q（林 祁），etal．A study of pollen wall ultrastructure ofKmeriaseptentrionalis［J］．BulletinofBotanicalResearch（木本植物研究），2000，20（4）：385－398（in Chinese）．