植物絨氈層異常導致花粉敗育的機理研究進展

羅海山，孟德璇，陳曉陽，羅紅兵*

(1湖南農業(yè)大學農學院，長沙410128;2中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京100193)

在開花植物中，花粉發(fā)育成熟是一個極其復雜的過程，期間涉及到花藥原基細胞的分裂分化，花粉母細胞的減數分裂和有絲分裂等過程?；ǚ鄣陌l(fā)育依賴于花藥壁細胞層尤其是絨氈層細胞的支持。植物的花藥一般有呈蝶形的4個花粉囊，每個花粉囊的囊壁從外向內分別是表皮層、藥室內壁、中層、絨氈層［1］，花粉小孢子位于花粉囊腔內。

有研究表明，絨氈層細胞發(fā)育過程中的任何異常，都可能直接或間接導致花粉粒的敗育，形成雄性不育［2，3］。對植物絨氈層細胞發(fā)育和分子機理的研究，將有助于更深入的了解花粉發(fā)育與雄性不育的分子機理，并利用生物技術創(chuàng)造可供生產中應用的優(yōu)良雄性不育系。

1 植物絨氈層的功能

植物絨氈層作為花藥壁最內層細胞，是向花粉母細胞運輸物質的樞紐，對花粉母細胞及后期小孢子的正常發(fā)育起著至關重要的作用［4］。

在花粉發(fā)育過程中，向花粉小孢子輸送營養(yǎng)物質是植物絨氈層最主要的功能之一，絨氈層細胞中的物質被極性轉運至向藥室面，并分泌到藥室中，從而為花粉母細胞減數分裂和花粉小孢子發(fā)育提供所需的營養(yǎng)［5］;在小孢子母細胞完成減數分裂形成四分體之后，絨氈層細胞適時的向外分泌胼胝質酶，用以分解四分體之間的胼胝質結構，釋放出小孢子細胞［6］。

此外，人們還在絨氈層上發(fā)現了烏氏體和絨氈層小體，它們分別在花粉壁和花粉包被的形成過程中起了重要的作用［7，8］。絨氈層的這些功能表明，絨氈層細胞是花粉粒成熟過程中一層極其重要的細胞，它與花粉粒的正常發(fā)育有著密切的聯系。

2 植物絨氈層異常導致花粉敗育的機理

2.1 細胞學機理

周巍等［9］認為，絨氈層細胞最靠近花粉母細胞，花粉母細胞發(fā)育所需營養(yǎng)主要來自絨氈層的供給，絨氈層發(fā)生異常，必然會引起花粉的發(fā)育異常。有研究［10，11］表明，絨氈層異常導致花粉小孢子敗育的原因主要是由于絨氈層細胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)造成的;調控絨氈層細胞PCD過程的基因一旦表達出現異常，都可能導致絨氈層細胞提前或者推遲降解，進而影響花粉小孢子的正常發(fā)育，最終形成雄性不育［12］。

曹媛等［13］在對毛白楊的研究中發(fā)現，絨氈層細胞Ca2+－ATPase的分布異常會影響絨氈層細胞的正常PCD進程，使絨氈層細胞無法正常降解，小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質得不到及時供應，導致了花粉的敗育。戴文懿等［14］發(fā)現，在擬南芥的溫敏雄性不育突變體atms1中，高溫環(huán)境會使花藥絨氈層PCD進程出現滯后，直到花粉粒發(fā)育后期仍無法正常降解，導致其不能產生正常的花粉粒，影響了植株的育性。盛英等［15］在對小麥不育系的研究中發(fā)現，由于RAFTIN1基因的提前高表達，導致絨氈層PCD異常而提前降解，小孢子無法得到充足的發(fā)育所需營養(yǎng)而形成雄性不育。

除了絨氈層細胞PCD進程異常的原因以外，花粉小孢子敗育也可能由于絨氈層細胞本身發(fā)育過程中出現異常造成。朱惠霞等［16］在對花椰菜不育系09－R9的試驗中發(fā)現，該突變體的絨氈層細胞發(fā)育異常，花粉囊內無絨氈層形成。許忠民等［17］發(fā)現，甘藍不育系CMS158在花粉母細胞四分體時期絨氈層細胞徑向膨大，細胞內含物極少，其營養(yǎng)無法滿足自身發(fā)育需要，反而通過徑向伸長以吸取小孢子四分體中營養(yǎng)，導致小孢子營養(yǎng)流失，不能正常生長發(fā)育而形成敗育。施展等［18］認為，大白菜不育系6w－9605A的敗育原因是絨氈層細胞異常膨大，擠壓小孢子，導致小孢子和絨氈層解體。

綜上所述，在正常的花藥中，絨氈層細胞完全成熟之后，細胞內富含花粉小孢子后期發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質，當小孢子從四分體釋放出來時，絨氈層便開始降解以提供小孢子發(fā)育營養(yǎng)和結構物質［19］，同時也能為花粉粒的完全成熟騰出空間。而PCD異?；蛘甙l(fā)育異常的絨氈層細胞，則無法正常向小孢子提供發(fā)育所需的營養(yǎng)物質，甚至占據了小孢子發(fā)育所需的空間，最終導致花粉的敗育。

2.2 分子學機理

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，在擬南芥和水稻等模式植物中鑒定克隆了一些與絨氈層發(fā)育相關的基因，使人們更深入的了解到調控植物絨氈層細胞發(fā)育過程的分子機制。由圖2可見，在花藥細胞分化早期，調控絨氈層發(fā)育的基因有AG、SPL/NZZ、EMS/EXS、TPD1、BAM1/BAM2以及 MPK3/MPK6 和ER/ERL1/ERL2［20～23］等。Toshiro Ito 等［24］發(fā)現，AG(Agamous)作為絨氈層發(fā)育早期的調控因子之一，位于SPL/NZZ(Sporocyteless/Nozzle)基因的上游，并通過激活SPL/NZZ基因的表達，共同調控花藥的發(fā)育;而SPL/NZZ基因編碼一個MADS－box轉錄因子家族的核蛋白，其功能與孢原細胞分化形成初生周緣細胞和初生造孢細胞的過程有關，突變體spl/nzz中的孢原細胞可以形成，但接著的細胞分裂會出現缺陷，導致絨氈層和造孢細胞缺失，造成雄性不育。

圖2 絨氈層發(fā)育的基因調控網絡模式圖［19］

Hord等［25］在擬南芥中發(fā)現了 BAM1(Barely Any Meristem 1)/BAM2，這對基因主要調控花藥發(fā)育早期細胞的特異分化，并且推測 BAM1/BAM2與SPL/NZZ可能在花藥中協同對造孢細胞和體細胞的數量平衡起正負調控的作用。

EMS1和TPD1對花藥發(fā)育早期偏后的時期起著調控作用。在擬南芥中，EMS1基因編碼了一個LRR－RLK蛋白受體激酶［26］，TPD1基因編碼1個含176個氨基酸的小蛋白;這兩個基因在細胞中的表達位置并不相同，EMS1主要在絨氈層中表達，而TPD1則主要是在小孢子母細胞中表達，它們的突變體表型類似，均是在花藥細胞層出現發(fā)育缺陷，突變體的絨氈層細胞被額外形成的小孢子母細胞所取代。Yang等［27］將TPD1基因在擬南芥中過表達時發(fā)現，突變體心皮的數目明顯增加，而在EMS1突變體中過表達TPD1基因時卻沒發(fā)現相同的變化，這證明了TPD1和EMS1可能在同一條調控途徑中起作用。

SERK1(Somatic Embryogenesis Receptor－Like Kinase 1)和SERK2基因編碼了一個LRR型的受體蛋白激酶，雙突變體表型為絨氈層缺失，產生較多小孢子母細胞，與ems1和tpd1的突變表型相類似，推測可能與EMS1和TPD1有比較相似的調控途徑［28］。Hord等［29］對 ER 家族(ER，ERL1，and ERL2)和MPK3(Mitogen－Activated Protein Kinase 3)/MPK6的研究中發(fā)現，這兩個基因家族的突變體也是在絨氈層的發(fā)育過程中出現了一層異常的細胞，然而在這類突變體中，EMS1和TPD1的表達均不受影響，所以推斷MPK3/MPK6和ER/ERL1/ERL2在絨氈層細胞的發(fā)育中可能有其獨立的調控途徑。

DYT1(DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1)是絨氈層發(fā)育中期表達的bHLH類型的轉錄因子，與水稻中的UDT1(UNDEVELOPED TAPETUM1)基因高度同源。Zhang等［30］研究發(fā)現，該基因位于 SPL/NZZ、EMS/EXS等基因調控途徑的下游，主要在絨氈層中表達，表達高峰期在花粉母細胞減數分裂早期和后期，突變體的絨氈層液泡化嚴重且不能降解，且小孢子母細胞減數分裂異常，無法形成正常的胼胝質壁，導致不能形成正常的小孢子。

TDF1(TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION1)、AMS(ABORTED MICROSPORES)、MYB103、MS1(MALE STERILITY 1)是調控絨氈層后期發(fā)育的4個主要轉錄因子?；虮磉_分析表明［19］，TDF1基因的作用位于AMS和MYB103基因的上游，DYT1的下游，該基因編碼了一個MYB家族轉錄因子，其突變體絨氈層細胞在發(fā)育的第7期高度液泡化，無法形成分泌型細胞，后期小孢子被擠在花粉囊中間且無法降解導致花粉敗育。

AMS與水稻中的TDR(TAPETUM DEGENERATION RETARDATION)基因同源，編碼了一個MYC類的轉錄因子，主要在花粉母細胞減數分裂后期的絨氈層細胞中表達，突變體表現為絨氈層細胞肥大、降解推遲導致的花粉不育［31］。

Zhang等［32］發(fā)現，MYB103 基因與絨氈層中胼胝質的降解以及花粉外壁的形成相關，通過對MYB103的表達分析發(fā)現，MYB103調控著MS2和A6啟動子的表達，其作用域位于MS1的上游。MS1基因通過編碼具有PHD－finger結構域的蛋白，調控絨氈層細胞和小孢子的發(fā)育，ms1突變體由于絨氈層發(fā)育異常，不能正常降解導致小孢子從四分體釋放后，無法形成正常的花粉壁而退化降解［33］。

3 其他影響絨氈層發(fā)育的相關基因

在水稻、油菜、玉米等其他大田作物中，也陸續(xù)報道了一些與絨氈層發(fā)育相關的基因。

在水稻中，Osc6、OsOPT9、MTR1等基因都與花藥絨氈層發(fā)育相關。Zhang等［34］研究發(fā)現，Osc6是TDR下游一個基因，在第9期到第11期的絨氈層和小孢子中特異表達，參與了絨氈層內脂類物質前體向其它花藥組織的運輸過程，水稻OsOPT9基因位于第八號染色體上，同源分析顯示它屬于水稻寡肽運輸家族，突變體花粉敗育是由于小孢子母細胞發(fā)育時期花藥的絨氈層過早脫落降解造成的［35］。MTR1是2012年由Tan等［36］克隆出來的一個水稻不育基因，它編碼了一個含有Fasciclin結構域的分泌性的糖蛋白，研究發(fā)現，該基因雖然在花粉母細胞中特異表達，卻影響了絨氈層細胞的發(fā)育，導致絨氈層細胞無法正常降解。

曾芳琴等［37］對油菜 SB45A不育系的研究發(fā)現，油菜BnCYP704BJ基因與孢粉素的合成有關，該基因的突變會導致絨氈層中脂類物質代謝的紊亂造成不育。夏秀云［1］推測，甘藍型油菜的不育相關基因BnATA20可能受TPD1的調控，突變體表現為絨氈層膨大擠壓小孢子，導致花粉敗育。

MAC1是調控玉米絨氈層形成及發(fā)育的一個重要基因，mac1突變體表現為絨氈層缺失，本應發(fā)育為絨氈層的細胞層被小孢子母細胞取代，由于絨氈層的缺失，小孢子母細胞不能完成減數分裂，最終沒有花粉產生［38］。

4 小結與展望

植物絨氈層細胞在花粉粒發(fā)育成熟過程中扮演著舉足輕重的角色，盡管目前人們對絨氈層的發(fā)育過程以及結構功能研究比較多，但是對其分子機理的了解還在探索中，比如絨氈層的PCD的精確調控機制還有待進一步研究，絨氈層異常產生大量液泡的作用機制還缺乏直接的分子生物學證據。

隨著生物科學技術的發(fā)展，對絨氈層機理研究的不斷深入，可以利用基因工程等成熟的技術條件，創(chuàng)造人工雄性不育系，來克服常規(guī)育種中時間上的局限性。前人研究［39］表明，將煙草中絨氈層的特異啟動子基因T29與外源基因Barnase(胞外核糖核酸酶)嵌合，在絨氈層中表達可以破壞絨氈層細胞，從而獲得雄性不育材料。目前該技術在煙草［40］、葡萄［41］、菜心［42］、甘藍［43］等作物上均有成功的例子。通過基因工程的方法來創(chuàng)建不育系，具有快速、高效、簡便等優(yōu)勢，不僅大大縮短了育種的周期，也節(jié)省了人力物力，在以后的育種工作中必將有著廣泛的應用前景。

［1］夏秀云.甘藍型油菜雄性不育相關基因BnATA20功能驗證［D］.華中農業(yè)大學，2011.

［2］宋江華，張立新.植物花粉發(fā)育的基因工程研究進展［J］. 中國農學通報，2008，24(12):92 －95.

［3］Huang MD，Hsing YI，Huang AH.Transcriptomes of the anther sporophyte:availability and uses［J］.Plant Cell Physiol，2011，52(9):1459 －1466.

［4］Pacini E.Tapetum character states:analytical keys for tapetum types and activities［J］.Can J Bot，1997，75(9):1448－1459.

［5］張英濤，楊海東，陳朱希昭.絨氈層研究進展［J］.植物學通報，1996，13(4):7 －14.

［6］譚何新，文鐵橋，張大兵.水稻花粉發(fā)育的分子機理［J］. 植物學通報，2007，24(3):330－339.

［7］李懿星，李 莉，陳光輝.高等植物花藥絨氈層發(fā)育研究進展［J］. 作物研究，2009，23(5):287－289.

［8］羅鑫娟，劉旭昊，王新宇.絨氈層小體，一種在花藥絨氈層細胞中新發(fā)現的含油細胞器［J］.細胞生物學雜志，2006，28(1):61 －65.

［9］周 巍，許 明.不結球白菜細胞核雄性敗育過程的細胞學研究［J］. 安徽農業(yè)科學，2007，35(6):1600－1601.

［10］Sanders PM，Lee PY，Biesgen C，et al.The Arabidopsis DELAYED DEHISCENCE1 gene encodes an enzyme in the jasmonic acid synthesis pathway ［J］.Plant Cell，2000，12(7):1041 －1061.

［11］Varnier AL，Mazeyrat－Gourbeyre F，Sangwan RS，et al.Programmed cell death progressively models the development of anther sporophytic tissues from the tapetum and is triggered in pollen grains during maturation ［J］.J Struct Biol，2005，152(2):118 －128.

［12］張 虹，梁婉琪，張大兵.花藥絨氈層細胞程序性死亡研究進展［J］.上海交通大學學報:農業(yè)科學版，2008，26(1):86 －90.

［13］曹 媛，康向陽，張志毅，等.毛白楊花粉敗育過程中Ca2+－ATPase的異常變化［J］.北京林業(yè)大學學報，2012，34(4):10 －17.

［14］戴文懿，孫亞梅，高 貝，等.擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1的獲得及表型分析［J］.上海大學學報:自然科學版，2011，17(5):681 －686.

［15］盛 英，張改生，李亞鑫，等.小麥生理型雄性不育花藥絨氈層和孢粉素變化與RAFTIN1表達的關系［J］.中國農業(yè)科學，2011，44(19):3937 －3944.

［16］朱惠霞，陶興林，胡立敏.花椰菜細胞質雄性不育系的細胞學研究［J］.中國蔬菜，2011，(18):64－67.

［17］許忠民，張恩慧，程永安，等.甘藍胞質雄性不育系CMS158小孢子發(fā)生的細胞學研究［J］.西北農業(yè)學報，2012，21(3):118 －121.

［18］施 展，萬正杰，徐躍進，等.大白菜新型細胞質雄性不育系6w－9605A的育性鑒定和花藥敗育的細胞學觀察［J］. 植物科學學報，2012，30(1):49－54.

［19］Zhu J，Chen H，Li H，et al.Defective in tapetal development and function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis［J］.Plant J，2008，55(2):266 －277.

［20］Schiefthaler U，Balasubramanian S，Sieber P，et al.Molecular analysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation and early sporogenesis during sex organ development in Arabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(20):11664 －11669.

［21］Yang SL，Xie LF，Mao HZ，et al.Tapetum determinant1 is required for cell specialization in the Arabidopsis anther［J］.Plant Cell.2003，15(12):2792 －2804.

［22］Zhao DZ，Wang GF，Speal B，et al.The excess microsporocytes1 gene encodes a putative leucine－rich repeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cell fates in the Arabidopsis anther［J］.Genes Dev，2002，16(15):2021 － 2031.

［23］Wilson ZA，Zhang DB.From Arabidopsis to rice:pathways in pollen development［J］.J Exp Bot，2009，60(5):1479－1492.

［24］Toshiro Ito，Wellmer F，Yu H，et al.The homeotic protein agamous controls microsporogenesis by regulation of SPOROCYTELESS［J］.Nature，2004，430:356 －360.

［25］Hord CL，Chen C，Deyoung BJ，et al.The BAM1/BAM2 receptor－like kinases are important regulators of Arabidopsis erly anther development［J］.Plant Cell，2006，8(7):1667－1680.

［26］Zhao DZ，Wang GF，Speal B，et al.The excess microsporocytes1 gene encodes a putative leucine－rich repeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cell fates in the Arabidopsis anther［J］.Genes Dev，2002，16(15):2021 － 2031.

［27］Yang SL，Jiang L，Puah CS，et al.Overexpression of TAPETUM DETERMINANT1 alters the cell fates in the Arabidopsis carpel and tapetum via genetic interaction with excessmicrosporocytes1/extra sporogenouscells［J］.Plant Physiol，2005，139(1):186 － 191.

［28］Albrecht C，Russinova E，Hecht V，et al.The Arabidopsis thaliana SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR－LIKE KINASES1 and 2 control male sporogenesis［J］.Plant Cell，2005，17(12):3337 － 3349.

［29］Hord CL，Sun YJ，Pillitteri LJ，et al.Regulation of Arabidopsis early anther development by the mitogen－activated protein kinases，MPK3 and MPK6，and the ERECTA and related receptor－ like kinases［J］.Mol Plant，2008，(4):645－658.

［30］Zhang W，Sun Y，Timofejeva L，et al.Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)encoding a putative bHLH transcription factor［J］.Development，2006，133(16):3085－3095.

［31］Sorensen AM，Krber S，Unte US，et al.The Arabidopsis aborted microspores(AMS)gene encodes a MYC class transcription factor［J］.Plant J，2003，33(2):413－423.

［32］Zhang ZB，Zhu J，Gao JF，et al.Transcription factor At-MYB103 is required for anther development by regulating tapetum development，callose dissolution and exine formation in Arabidopsis［J］.Plant J，2007，52(3):528 －538.

［33］Wilson ZA，Morroll SM，Dawson J，et al.The Arabidopsis MALE STERILITY1(MS1)gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis，with homology to the PHD － finger family of transcription factors［J］.Plant J，2001，28(1):27 －39.

［34］Zhang D，Liang W，Yin C，et al.OsC6，encoding a lipid transfer protein，is required for postmeiotic anther development in rice［J］.Plant Physiol，2010，154(1):149－162.

［35］劉 滔，夏快飛，曾紀晴，等.水稻OsOPT9基因的在花藥發(fā)育中的作用研究［A］.見:中國遺傳學會，等.2011年全國植物生物學研討會論文集［C］.2011.

［36］Tan H，Liang W，Hu J，et al.MTR1 encodes a secretory fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in rice［J］.Dev Cell，2012，22(6):1127－1137.

［37］曾芳琴.油菜S45AB隱性核不育分子機理與應用研究［D］.武漢:華中農業(yè)大學，2010.

［38］Sheridan WF，Golubeva EA，Abrhamova LI，et al.The mac1 mutation alters the developmental fate of the hypodermal cells and their cellular progeny in the maize anther［J］.Genetics，1999，153(2):933 －941.

［39］Hartley RW.Barnase and barstar:two small proteins to fold and fit together［J］.Trends Biochem Sci，1989 ，14(11):450－454.

［40］韓鳳英，韓學智，鄒 敏，等.BcA9－Barnase轉基因雄性不育煙草的獲得［J］.西南大學學報(自然科學版)，2012，34(4):58 －64.

［41］楊麗娜，劉 捷，莊智敏，等.根癌農桿菌介導Barnase基因轉化‘美人指’葡萄的研究［J］.南京農業(yè)大學學報，2009，32(1):31 －35.

［42］曹必好，孟成民，雷建軍，等.TA29－barnase基因轉化菜心［J］. 生物工程學報，2008，24(5):881－886.

［43］朱玉英，龔 靜，吳曉光，等.甘藍轉 TA29－Barnase基因植株的花器特征及育性分離的初步研究［J］.上海農業(yè)學報，2001，17(1):79 －82.