睡菜離體快繁技術(shù)的研究

趙 峰，胡若洋，杜思樂，石雪飛，李學東

（首都師范大學 生命科學學院，北京100048）

睡菜（MenyanthestrifoliataL．）又名螟菜、醉草，為龍膽科睡菜屬多年沼生草本植物，根狀莖匍匐粗大，初為綠色，老熟后轉(zhuǎn)為褐色，三出復(fù)葉，小葉卵圓形，挺出水面，總狀花序具多花，花白色，花冠背面常帶粉色，上部內(nèi)面具白色流蘇狀毛，蒴果球形，種子膨脹，圓形，花果期5～7月，在中國分布于東北、華北、云南、西藏及四川等地［1］?？善灿诤恿?、湖泊、池塘淺水處，極具觀賞價值（圖版Ⅰ，A～G）。睡菜的栽培繁殖以分株繁殖為主，多在每年的3～5月進行，將根狀莖分割，具3～4個芽眼分栽即可，也可播種繁殖［2］。其在濕地植被恢復(fù)和植物多樣性重建等方面具有很好的應(yīng)用前景。

在瑞典睡菜是用于治療腎炎和急性腎功能衰竭的一種傳統(tǒng)藥物，并且對于壞血病及其它疾病也具有顯著療效［3－4］。通過將睡菜根莖提取物施加于100～120g大鼠后研究發(fā)現(xiàn)：睡菜可抑制血小板活化因子（PAF），從而防止急性腎功能衰竭［5－6］。研究表明，睡菜具有顯著的免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用，這可能與其體內(nèi)復(fù)雜的免疫多糖組分［7－8］有關(guān)。其兼具抗腫瘤的生物活性，前蘇聯(lián)在1982年就已經(jīng)有利用睡菜與五氟尿嘧啶制劑配合成功治療25例胃癌晚期患者的相關(guān)報道［9］。同時，睡菜還具有清熱利尿、健胃、安神的作用，并可作蔬菜，具有很高的藥用價值及廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。

對于睡菜的組織培養(yǎng)研究國內(nèi)外研究報道極少，2012年吳昌宇等［10］對其外植體消毒和愈傷組織誘導(dǎo)進行了初步研究報道。李文潔等［11］對產(chǎn)自云南的睡菜進行了離體培養(yǎng)與植物再生研究，但其消毒方法、培養(yǎng)基成分和激素配比都比較復(fù)雜。本研究旨在探索一種簡便、快速的睡菜離體繁殖技術(shù)，為睡菜種苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1．1 材 料

實驗材料采自北京延慶縣野鴨湖自然保護區(qū)長勢良好的睡菜植株，該材料于2007年在北京延慶縣濕地資源普查時被發(fā)現(xiàn)，為北京新記錄種［12］。

1．2 方 法

1．2．1 培養(yǎng)基配置 本實驗選用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，瓊脂含量0．8%，蔗糖濃度3%，pH 5．8～6．0，在121℃、0．15 MPa條件下滅菌20min。

1．2．2 外植體消毒 取10cm 睡菜嫩莖段為外植體（以休眠期取材為宜，可顯著減少污染幾率），用自來水沖洗1～2h，去除葉和根。然后在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30s，放入1g／L HgCl2中消毒10min。用無菌水沖洗5次，浸泡5min，將消毒的材料切成0．5cm 厚薄片。

1．2．3 愈傷組織誘導(dǎo) 配制5組不同激素濃度的培養(yǎng)基（表1），每組重復(fù)4瓶，每瓶中接種3塊相同睡菜嫩莖，培養(yǎng)15d。培養(yǎng)條件為（20±2）℃，12 h／12h光照，光強1 000～2 000lx，相對濕度50%～70%。定期觀察，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)／總接種數(shù)

1．2．4 愈傷組織繼代培養(yǎng) 配制4種不同激素濃度的培養(yǎng)基（表2），每組重復(fù)4瓶，每瓶接種3塊愈傷組織。培養(yǎng)條件為（20±2）℃，12h／12h光照，光強1 000～2 000lx，相對濕度50%～70%。定期觀察，統(tǒng)計愈傷組織增長率。

愈傷組織增長率＝增長愈傷組織數(shù)／總接種數(shù)

1．2．5 芽的誘導(dǎo) 設(shè)計采用雙因素實驗，共26組激素濃度梯度（表3），篩選適宜誘導(dǎo)睡菜愈傷組織出芽的NAA 和6－BA 激素濃度。將培養(yǎng)的愈傷組織接種到出芽培養(yǎng)基上，每組重復(fù)4瓶，每處理重復(fù)3次。定期觀察，統(tǒng)計愈傷組織出芽率。

愈傷組織出芽率＝出芽愈傷組織數(shù)／總接種數(shù)

1．2．6 誘導(dǎo)生根及移栽 篩選最適宜誘導(dǎo)睡菜愈傷組織出根的NAA 和6－BA 激素濃度。設(shè)計采用雙因素實驗，共設(shè)置26組激素濃度梯度（表4）。將帶芽的再生小苗接種于不同激素配比的生根培養(yǎng)基上，每組重復(fù)4瓶，每個處理重復(fù)3次。定期觀察，統(tǒng)計平均生根率（平均生根率＝生根小苗數(shù)／總接種數(shù)）。得到的完整再生植株移栽于底部覆有滅菌土壤的水槽中，定期觀察其生長狀況，統(tǒng)計成活率（成活率＝成活植株數(shù)／總移栽數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2．1 睡菜愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

將消毒后的睡菜嫩莖段接種至培養(yǎng)基上（圖版Ⅱ，A）。培養(yǎng)基中不加激素時，睡菜不能形成愈傷組織。當激素濃度在0．5～1．5mg／L 6－BA、0．05～0．15mg／L NAA 時，可形成淺綠色的愈傷組織（圖版Ⅱ，B）。當培養(yǎng)基中激素含量為1．0mg／L 6－BA和0．1 mg／L NAA 時，睡菜愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，達到100%（表1）。由此推斷，最適宜的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋1 mg／L 6－BA＋0．1 mg／L NAA。

在外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，需要及時進行繼代培養(yǎng)，以避免培養(yǎng)過程中微生物通過封口膜污染及培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗引起的愈傷組織老化死亡。在繼代培養(yǎng)中，仍然選擇不同濃度6－BA 和NAA 來調(diào)控愈傷組織的生長。結(jié)果（表2）顯示，睡菜愈傷組織在激素濃度范圍為MS＋0．3～1．5mg／L 6－BA＋0．03～0．15 mg／L NAA 的培養(yǎng)基中均可進行增殖。其中在MS＋1mg／L 6－BA＋0．1mg／L NAA培養(yǎng)基中愈傷組織生長最好，愈傷組織生長率可達91．67%。

表1 不同激素配比對睡菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different media on inducing calli of M．trifoliata

2．2 芽的誘導(dǎo)

由表3可知，在編號Y11～Y26的培養(yǎng)基中除其他均可誘導(dǎo)出芽且比較集中（圖版Ⅱ，C～R）。

表3顯示，在不同時期培養(yǎng)基Y18的誘導(dǎo)出芽率均出現(xiàn)最大值，推測睡菜最適誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基為編號Y18（圖版Ⅱ，J）。重復(fù)接種和二次繼代該培養(yǎng)基的出芽率均可達到50%以上，即最適芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS＋0．3mg／L NAA＋4mg／L 6－BA。

2．3 根的誘導(dǎo)及再生植株移栽

對根誘導(dǎo)需在出芽的基礎(chǔ)上進行，當最初產(chǎn)生愈傷組織的時候，需使細胞分裂加快，即細胞分裂素／生長素（6－BA／NAA）的比值大時，更易誘導(dǎo)出芽。后期誘導(dǎo)生根形成完整再生植株的過程中，生長素起著更關(guān)鍵的作用。設(shè)計雙因子實驗，篩選最適宜誘導(dǎo)睡菜愈傷組織生根的NAA 和6－BA 濃度。

表2 不同激素配比對睡菜愈傷組織生長的影響Table 2 Effect of different media on inducing calli of M．trifoliata

表3 不同水平NAA和6－BA對睡菜芽的誘導(dǎo)Table 3 Effect of different mediums（NAA／6－BA）on inducing buds of M．trifoliata

表4 不同水平NAA和6－BA對睡菜根的誘導(dǎo)Table 4 Effect of different mediums（NAA／6－BA）on taking roots of M．trifoliata

表5 溫度、光照強度對睡菜移栽苗的影響Table 5 The influence of temperature and light intensity on transplants

將生長情況良好的帶芽愈傷組織接入不同激素濃度的培養(yǎng)基（表4）中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號G12和G13培養(yǎng)基內(nèi)愈傷組織在1周內(nèi)均誘導(dǎo)出根，并且生根率很高（圖版Ⅱ，S～V）。尤其G12培養(yǎng)基重復(fù)接種后可達100%的出根率（表4），說明最適宜誘導(dǎo)根的培養(yǎng)基是MS＋1 mg／L NAA＋0．3 mg／L 6－BA。形成的再生植株可選潮濕的雨天移栽于室外水池中，1周左右即可挺出水面（圖版Ⅱ，X）。

獲得睡菜完整再生植株移栽至不同溫度、照度的培養(yǎng)箱中，觀察不同培養(yǎng)條件對睡菜生長的影響。以移栽后20d為標準測量不同培養(yǎng)條件下睡菜的挺水高度，計算生長速率（生長速率＝挺水高度／生長時間）。結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)光照強度及培養(yǎng)溫度對睡菜的生長均有影響，低溫、弱光條件下睡菜的生長受到明顯抑制，其中溫度對睡菜的生長影響較為明顯。睡菜的培養(yǎng)要求溫度較高，因此初夏移栽應(yīng)為最宜。

3 討 論

睡菜作為一種水生植物，其外植體的消毒是一個難題，其中外植體的取材時間是首先要考慮的因素［13］。從入秋到春季萌芽前的休眠期取材，再把睡菜嫩莖段用1g／L 的多菌靈懸濁液浸泡24h，可大大降低其染菌的概率。

誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基配制時，總會出現(xiàn)培養(yǎng)基沒有凝結(jié)的情況。經(jīng)反復(fù)配制發(fā)現(xiàn)，激素的濃度很容易影響培養(yǎng)基的酸堿度。高濃度的6－BA 使培養(yǎng)基過于偏酸，致使培養(yǎng)基不易凝結(jié)。因此配制前將6－BA濃度高于6mg／L的培養(yǎng)基pH 提前調(diào)至6．3，這樣所制作的培養(yǎng)基更易凝結(jié)。

再生小苗的室外移栽由于易受外源微生物和原生動物的侵染，致使其成活率僅有30%左右。延長睡菜在無菌瓶中的生長期可以達到壯苗的目的，并有利于提高移栽的成活率［14］。將利用植物組織快繁技術(shù)得到的再生小苗轉(zhuǎn)移到經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃／30min）的土及蒸餾水中先培養(yǎng)1周。壯苗后的睡菜再移栽于室外可達100%的成活率。睡菜耐寒而不耐旱，培養(yǎng)過程中要及時補水，防止由于水分蒸發(fā)造成的缺水脅迫。

睡菜作為少有的濕地觀花植物具有很高的觀賞價值和藥用價值，利用植物離體快繁技術(shù)，通過改變MS培養(yǎng)基中6－BA、NAA 的濃度，建立睡菜組織培養(yǎng)無性系，30d左右便可得到大量的再生苗，有利于睡菜的進一步推廣和普及。

圖版Ⅰ 睡菜自然景觀及再生植株煉苗實驗PlateⅠ The natural landscape and hardening experiments of M．trifoliata

圖版Ⅱ 睡菜組織培養(yǎng)過程PlateⅡ The process of tissue culture on M．trifoliata

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