不同胰腺提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

許聿新，井慶平

(淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200)

不同胰腺提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

許聿新，井慶平

(淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200)

目的 探討不同胰腺提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。方法 制備模擬胰腺微環(huán)境的大鼠正常及再生性胰腺提取物，同時(shí)分離培養(yǎng)鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。分別應(yīng)用正常及再生性胰腺提取物孵育間充質(zhì)干細(xì)胞獲得條件培養(yǎng)液，并設(shè)立無(wú)胰腺提取物處理的對(duì)照組；ELISA法檢測(cè)三組條件培養(yǎng)液中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性表皮生長(zhǎng)因子(bFGF)的含量，應(yīng)用RT-PCR分析胰腺提取物對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞中四種細(xì)胞因子 mRNA的改變。結(jié)果 三組均可以檢測(cè)到IGF-1、HGF、bFGF及VEGF，其中再生性胰腺提取物處理的條件培養(yǎng)液組中四種細(xì)胞因子含量最高，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。再生性胰腺提取物處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的IGF-1、HGF、VEGF及bFGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量與其他兩組相比均明顯升高(P均<0.05)。結(jié)論 模擬糖尿病胰腺微環(huán)境的再生性大鼠胰腺提取物可以促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多的具有胰腺保護(hù)作用的細(xì)胞因子。

糖尿??；胰腺提取物；干細(xì)胞，骨髓；細(xì)胞因子類

糖尿病的共同發(fā)病基礎(chǔ)是有功能的胰島β細(xì)胞團(tuán)絕對(duì)或相對(duì)不足。研究發(fā)現(xiàn)，移植間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以部分逆轉(zhuǎn)糖尿病動(dòng)物模型的高血糖狀態(tài)[1，2]，但其機(jī)制尚未闡明，移植到體內(nèi)的MSCs是否能分化為胰島素分泌細(xì)胞并發(fā)揮“替代補(bǔ)充”作用仍存在爭(zhēng)議[3，4]。2013年8月～2014年5月，我們應(yīng)用大鼠胰腺提取物(RPE)在體外模擬胰腺微環(huán)境，探討RPE對(duì)MSCs細(xì)胞因子表達(dá)及分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量150～200 g，清潔級(jí)，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。儀器及試劑：PCR儀(MJ Research公司，美國(guó))、電泳成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國(guó))、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(INTEC公司，Reader 2010型)、流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER公司)、細(xì)胞總RNA提取使用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒，PCR試劑盒(大連寶生物公司，中國(guó))，ELISA試劑盒(Adlitteram Diagnostic laboratories，USA)。

1.2 方法

1.2.1 RPE的制備[5]大鼠麻醉后，行胰腺大部分切除。48 h后，找到并切除殘留胰腺(即再生胰腺)，經(jīng)勻漿化處理，離心抽濾，即再生性大鼠胰腺提取物(R-RPE)。正常胰腺提取物(N-RPE)為未行胰腺大部切除的正常胰腺直接經(jīng)過(guò)勻漿處理后提取的提取液。

1.2.2 大鼠MSCs條件培養(yǎng)液的制備 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠MSCs，取第三代MSCs培養(yǎng)于含10% FBS的LG-DMEM的培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合至80%后，培養(yǎng)基中分別加入R-RPE及N-RPE，培養(yǎng)7 d，去除含RPE培養(yǎng)液，以無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs 48 h，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。根據(jù)處理方式不同分為三組：無(wú)RPE對(duì)照組(CTR-CM)，N-RPE處理組(N-RPE-CM)和R-RPE處理組(R-RPE-CM)。

1.2.3 大鼠MSCs條件培養(yǎng)液細(xì)胞因子檢測(cè) 應(yīng)用ELISA法測(cè)定大鼠MSCs條件培養(yǎng)液上清的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性表皮生長(zhǎng)因子(bFGF)水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 大鼠MSCs分泌細(xì)胞因子mRNA檢測(cè) 取經(jīng)過(guò)R-RPE、N-RPE處理及未經(jīng)處理的MSCs，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞。采用TRIzol試劑一步法提取總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一條cDNA，所得cDNA用于PCR擴(kuò)增，設(shè)立β-actin作為內(nèi)參照，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[6]，由上海博亞生物公司合成；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物mRNA，紫外線下觀察電泳結(jié)果并照相，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 骨髓MSCs形態(tài)及細(xì)胞表型 大鼠骨髓細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)48 h后可見散在貼壁細(xì)胞。7～10 d后，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯增多，呈梭形或長(zhǎng)多邊形，細(xì)胞排列整齊。原代培養(yǎng)10～14 d細(xì)胞80%～90%融合，有規(guī)律地排列成放射狀或旋渦狀。按1∶2的比例傳代，傳代后的MSCs形態(tài)與原代基本相似，經(jīng)過(guò)3代后MSCs基本達(dá)到形態(tài)均一。流式細(xì)胞儀分析第三代MSCs細(xì)胞表型，細(xì)胞高表達(dá)CD44和CD90，而CD34、CD45低表達(dá)或表達(dá)陰性。

2.2 三組IGF-1、HGF、bFGF和VEGF水平比較 四種細(xì)胞因子在三組培養(yǎng)液上清中均可以檢測(cè)到，其中R-RPE-CM組及N-RPE-CM組中四種細(xì)胞因子與CTR-CM組相比均明顯升高(P均<0.05)，R-RPE-CM組四種細(xì)胞因子水平高于N-RPE-CM組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組IGF-1、HGF、bFGF和VEGF 水平比較

注：與CTR-CM組相比，#P<0.05；與N-RPE-CM組相比，*P<0.05。

2.3 三組IGF-1、HGF、bFGF和VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，與CTR-CM組相比，經(jīng)過(guò)N-RPE和R-RPE處理MSCs的IGF-1、HGF、VEGF及bFGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。R-RPE組與N-RPE組比較，IGF-1、HGF、VEGF及bFGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量也均明顯升高(P均<0.05)。見表2。

表2 三組IGF、HGF、bFGF和VEGF的mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與CTR-CM組相比，#P<0.05；與N-RPE-CM組相比，*P<0.05。

3 討論

骨髓MSCs在體外易分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，植入體內(nèi)僅有低免疫排斥反應(yīng)，是糖尿病再生治療研究的熱點(diǎn)。移植到體內(nèi)的MSCs定位到受損的糖尿病胰腺中可以促進(jìn)宿主胰島細(xì)胞的再生，胰島素分泌增加，發(fā)揮降血糖作用。我們推測(cè)，MSCs可能通過(guò)分泌具有胰腺保護(hù)作用及促進(jìn)胰島細(xì)胞增生的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用[7]。

骨髓MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子參與細(xì)胞形態(tài)的維系及組織發(fā)育，在不同的微環(huán)境下，MSCs分泌的細(xì)胞因子具有高度的可塑性。移植MSCs入心肌梗死患者體內(nèi)，可以促進(jìn)心肌細(xì)胞增生，有效減少梗死面積，改善心功能[8,9]。移植MSCs至腦梗死患者，可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，從而改善患者神經(jīng)功能[10,11]。以上研究證實(shí)了MSCs分泌的細(xì)胞因子及發(fā)揮的作用與其定位的微環(huán)境有密切關(guān)系。

通過(guò)部分胰腺切除后獲得再生性胰腺，經(jīng)過(guò)勻漿化處理后得到的再生性胰腺提取物，被認(rèn)為可模擬受損的胰腺微環(huán)境，更接近于糖尿病患者的胰腺微環(huán)境[12,13]。我們?cè)隗w外應(yīng)用胰腺提取物孵育MSCs，模擬MSCs移植后定居于胰腺在胰腺微環(huán)境下MSCs分泌細(xì)胞因子的變化，結(jié)果顯示，有胰腺保護(hù)作用的相關(guān)細(xì)胞因子如IGF-1、HGF、bFGF和VEGF的分泌增加，相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并且應(yīng)用再生性胰腺提取物處理后與正常胰腺提取物相比，細(xì)胞因子的分泌及基因表達(dá)升高更明顯，提示模擬受損胰腺微環(huán)境的再生胰腺提取物可以改變MSCs的基因表達(dá)，有胰腺保護(hù)作用的細(xì)胞因子表達(dá)和分泌明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)MSCs細(xì)胞因子的分泌與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。

在1型糖尿病的發(fā)生過(guò)程中，自身免疫攻擊導(dǎo)致體內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)胰腺細(xì)胞壞死、凋亡，胰腺在病理情況下啟動(dòng)胰島的再生。移植MSCs到糖尿病動(dòng)物模型后，定居于胰島的MSCs分泌細(xì)胞因子的能力在再生性胰島環(huán)境下被激活，分泌具有胰腺保護(hù)作用細(xì)胞因子，發(fā)揮促進(jìn)胰腺細(xì)胞再生，抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而使胰島細(xì)胞團(tuán)數(shù)量增加，分泌胰島素，降低血糖。MSCs在受損胰腺微環(huán)境下的旁分泌效應(yīng)可能是改善糖尿病動(dòng)物模型糖代謝的機(jī)制。

[1] Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, et al. In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow[J]. Diabetes, 2004,53(7):1721-1732.

[2] Gabr MM, Zakaria MM, Refaie AF, et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stem cells control streptozotocin-induced diabetes in nude mice[J]. Cell Transplant, 2013,22(1):133-145.

[3] Chhabra P, Brayman KL.Stem cell therapy to cure type 1 diabetes: from hype to hope[J]. Stem Cells Transl Med, 2013,2(5):328-336.

[4] Choi JB, Uchino H, Azuma K, et al. Little evidence of transdifferentiation of bone marrow-derived cells into pancreatic beta cells[J]. Diabetologia, 2003,46(10):1366-1374.

[5] Gao X, Song L, Shen K, et al. Transplantation of bone marrow derived cells promotes pancreatic islet repair in diabetic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008,371(1):132-137.

[6] Lee J, Han DJ, Kim SC. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008,375(4):547-551.

[7] Li X, Zhang L, Meshinchi S, et al. Islet microvasculature in islet hyperplasia and failure in a model of type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2006,55(11):2965-2973.

[8] Gnecchi M, Danielip P, Cervia E. Mesenchymal stem cell therapy for heart disease[J]. Vascul Pharmacol, 2012,57(1):48-55.

[9] Kuraitis D, Ruel M, Suuronen EJ. Mesenchymal stem cell therapy for cadiovascular regeneration [J]. Cardiovasc Drug Ther, 2011,25(4):349-362.

[10] Kim SJ, Choi SW, Hur KJ. Synergistic effect of mesenchymal stem cells infected with recombinant adenovirus expressing human BDNF on erectile function in a rat model of cavernous nerve injury[J]. Korean Urol, 2012,53(10):726-732.

[11]Motoyoshi YA, Tamura M, Moriyama M. Activation of cultured atrocities by amphotericin B: Stimulation of NO and cytokines production and changes in neurotrophic factors production[J]. Neurochem Int, 2013,5:232-240．

[12] Hardikar AA, Bhonde RR. Modulating experimental diabetes by treatment with cytosolic extract from the regenerating pancreas[J]. Diabetes Res Clin Pract, 1999,46(3):203-211.

[13] Choi KS, Shin JS, Lee JJ, et al. In vitro trans-differentiation of rat mesenchymal cells into insulin-producing cells by rat pancreatic extract[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,330(4):1299-1305.

井慶平

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.009

R587.1

A

1002-266X(2015)01-0025-03

2014-08-12)