司超+姚曉芹+賀學(xué)禮+楚建周

摘要：采用正交試驗(yàn)，考察提取顯色條件對(duì)藥用菊花中綠原酸提取與測(cè)定的影響。結(jié)果表明，菊花中綠原酸提取測(cè)定最優(yōu)方法為用80%甲醇作提取劑，超聲提取30 min，加0.02 mol/L FeCl3 0.5 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)，靜置30 min后在分光光度計(jì)755 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性強(qiáng)，可用于菊花中綠原酸的提取測(cè)定。

關(guān)鍵詞：菊花;綠原酸;超聲提取;分光光度法

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0264-03

收稿日期：2014-05-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31300321）;河北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C2012201080）;河北大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2013080）。

作者簡(jiǎn)介：司 超（1985—），女，山東滕州人，碩士研究生，主要從事藥用植物次生代謝研究。E-mail：sisi19851204@163.com。

通信作者：姚曉芹，博士，副教授，主要從事藥用植物次生代謝、植物逆境生理研究。E-mail：yaoxiao301@126.com。

菊花為多年生菊科草本植物，以頭狀花序入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，主要功效有散風(fēng)清熱、平肝明目、解毒、降壓等，主治風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、明目昏花等癥[1]。綠原酸是菊花主要的活性成分，它是植物體在有氧呼吸過(guò)程中合成的一種苯丙素類(lèi)物質(zhì)，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利膽等多種功效[2-3]。目前，提取藥用植物中綠原酸采用的方法主要有超高壓提取法、熱回流法、溶劑浸提法、酶解法、微波輔助萃取法、超聲提取法等[4-7]。綠原酸含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法等[8-10]。有學(xué)者利用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定綠原酸含量，該方法主要是利用綠原酸能與FeCl3進(jìn)行特殊的顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定植物中綠原酸含量，具有原理簡(jiǎn)單、儀器常見(jiàn)、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11]。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)超聲提取、顯色條件進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步完善采用可見(jiàn)分光光度法快速測(cè)定植物中綠原酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），240W PS-40A型數(shù)控超聲波清洗器（深圳市康潔洗凈電器有限公司）。主要試劑：標(biāo)準(zhǔn)綠原酸（純度95%，阿拉丁試劑上海有限公司）、FeCl3溶液、甲醇、乙醇。筆者所在實(shí)驗(yàn)室種植的懷菊，將菊花頭狀花序在105 ℃下殺青30 min，55～60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，粉碎、過(guò)篩，混勻備用。

1.2 超聲波提取條件優(yōu)化

1.2.1 提取溶劑 用60%甲醇、60%乙醇進(jìn)行提取溶劑試驗(yàn)，比較不同提取劑對(duì)綠原酸提取效果的影響。取0.3 g干樣，分別加入15 mL 60%甲醇、15 mL 60%乙醇溶液，超聲提取30 min，過(guò)濾后用提取溶劑定容至25 mL刻度管內(nèi);取1 mL上述溶液加4 mL提取溶劑，置于10 mL刻度管中，加0.5 mL 0.02 mol/L FeCl3溶液（分別用60%甲醇、60%乙醇配制）振蕩搖勻后靜置60 min，用722型分光光度計(jì)于755 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，確定最佳提取溶劑。

1.2.2 提取容器 選擇等容積的燒杯、錐形瓶、塑料瓶、試管進(jìn)行試驗(yàn)，提取溶劑為60%甲醇溶液，提取方法、測(cè)定步驟同“1.2.1”節(jié)，比較提取容器對(duì)綠原酸提取效果的影響。

1.2.3 浸泡時(shí)間 用甲醇提取液分別浸泡樣品0、3、6、12、18、24 h后進(jìn)行超聲提取，測(cè)定方法同“1.2.1”節(jié)，比較浸泡時(shí)間對(duì)綠原酸提取效果的影響。

1.2.4 提取時(shí)間 用甲醇提取液分別超聲提取樣品10、20、30、40、50、60 min，測(cè)定方法同“1.2.1”節(jié)，比較超聲提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取效果的影響。

1.2.5 提取次數(shù) 用甲醇提取液分別經(jīng)超聲波提取樣品1、2、3、4次，每次時(shí)間10 min，每次加入最佳提取溶劑5 mL，提取完成后合并每次的提取液，過(guò)濾并定容，測(cè)定方法同“1.2.1”節(jié)，比較提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取效果的影響。

1.2.6 提取溶劑濃度 分別用20%、40%、60%、80%、100%甲醇溶液提取樣品，其他條件為已選出的最佳條件，測(cè)定方法同“1.2.1”節(jié)方法，比較不同濃度甲醇提取液對(duì)綠原酸提取效果的影響。

1.3 顯色條件優(yōu)化

配制0.01、0.02、0.03 mol/L FeCl3-甲醇顯色溶液，顯色時(shí)分別在樣品液中加入0.5、1.0 mL進(jìn)行試驗(yàn)，提取條件采用“1.2”節(jié)的優(yōu)化條件。

1.4 正交試驗(yàn)

在提取、顯色條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選出最優(yōu)水平組合。選取對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大的2個(gè)因素，即提取劑濃度、顯色劑用量進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10 mg，加入最佳提取溶劑溶解并定容至50 mL，制成200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。在7個(gè)10 mL刻度管內(nèi)分別加入0、1、2、3、4、5、6 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用80%甲醇稀釋至標(biāo)線，分別制成0、20、40、60、80、100、120 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。按“1.3”節(jié)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行顯色、測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑對(duì)綠原酸提取效果的影響 綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚3個(gè)不穩(wěn)定部分，可以利用甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑從植物中提取出來(lái)。筆者分別以甲醇、乙醇為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以乙醇為提取劑在顯示過(guò)程中容易出現(xiàn)沉淀，因此下面其他優(yōu)化試驗(yàn)都用甲醇作為提取溶劑。endprint

2.1.2 提取容器對(duì)綠原酸提取效果的影響 由表1可知，試管提取效果最佳，另外，利用試管作為提取容器操作更方便。因此，本試驗(yàn)選用試管作為提取容器。

表1 不同容器對(duì)綠原酸提取效果的影響

容器 D755nm

燒 杯 0.188±0.005b

錐形瓶 0.181±0.007ab

塑料瓶 0.189±0.009ab

試 管 0.211±0.004a

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）。下表同。

2.1.3 樣品浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取效果的影響 由表2至表4可知，浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)綠原酸提取沒(méi)有顯著影響，因此選擇不浸泡，超聲提取1次，提取時(shí)間為30 min。

2.1.4 提取溶劑濃度對(duì)綠原酸提取效果的影響 由表5可知，甲醇濃度對(duì)菊花中綠原酸的提取效果有顯著影響。提取

表2 浸泡時(shí)間對(duì)綠原酸提取效果的影響

浸泡時(shí)間（h） D755 nm

24 0.157±0.009b

18 0.162±0.004ab

12 0.166±0.002ab

6 0.168±0.003ab

3 0.167±0.003ab

0 0.178±0.003a

表3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取效果的影響

提取時(shí)間（min） D755 nm

60 0.213±0.002a

50 0.192±0.011a

40 0.195±0.008a

30 0.202±0.003a

20 0.184±0.010a

10 0.205±0.006a

表4 提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取效果的影響

提取次數(shù)（次） D755 nm

4 0.189±0.002a

3 0.183±0.002a

2 0.163±0.004b

1 0.160±0.007b

液吸光度隨甲醇濃度的增加而增大。當(dāng)甲醇濃度≤60%時(shí)，提取液吸光度隨著濃度的增加變化比較劇烈，當(dāng)甲醇濃度>60%時(shí)，提取液吸光度變化比較平緩，并且80%、100%甲醇處理對(duì)綠原酸的提取效果差異不顯著。

表5 提取溶劑濃度對(duì)綠原酸提取效果的影響

甲醇濃度（%） D755 nm

20 0.028±0.003d

40 0.078±0.006c

60 0.195±0.004b

80 0.218±0.000a

100 0.222±0.003a

2.2 顯色條件優(yōu)化

表6表明，當(dāng)顯色劑濃度為0.01 mol/L、用量為0.5 mL時(shí)，樣品產(chǎn)生沉淀，這可能是因?yàn)镕eCl3含量不足;當(dāng)顯色劑濃度為0.02 mol/L、用量為0.5 mL時(shí)，吸光度最大;當(dāng)顯色劑濃度為0.03 mol/L時(shí)，吸光度顯著降低。

表6 顯色劑濃度及用量對(duì)綠原酸提取效果的影響

顯色劑濃度

（mol/L） 顯色劑用量

（mL） D755 nm

0.01 0.5 0（沉淀）

1.0 0.165±0.004b

0.02 0.5 0.182±0.004a

1.0 0.101±0.002d

0.03 0.5 0.136±0.003c

1.0 0.077±0.001e

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

選取對(duì)綠原酸提取、顯色影響明顯的因子進(jìn)行正交試驗(yàn)。以提取劑濃度、0.02 mol/L顯色劑FeCl3的用量為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn) （表7、表8）。由此可知，最優(yōu)水平組合為A2B2，即甲醇濃度80%，顯色劑用量0.5 mL。

表7 正交試驗(yàn)因素水平

水平

因素

A：提取劑濃度（%） B：顯色劑用量（mL）

1 60 0.25

2 80 0.50

3 100 0.75

4 1.00

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

序號(hào)

因素水平

A：提取劑濃度 B：顯色劑用量

吸光度

1 1 1 0（沉淀）

2 1 2 0.206±0.001d

3 1 3 0.170±0.002e

4 1 4 0.154±0.002f

5 2 1 0.269±0.004a

6 2 2 0.239±0.003b

7 2 3 0.224±0.002c

8 2 4 0.217±0.003c

9 3 1 0.240±0.004b

10 3 2 0.239±0.003b

11 3 3 0.240±0.004b

12 3 4 0.237±0.005b

k1 0.177 0.127

k2 0.316 0.171

k3 0.319 0.159

k4 0.152

極差R 0.142 0.044

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液5 mL，加入顯色劑FeCl3-甲醇溶液0.25 mL充分振蕩，靜置30 min后于波長(zhǎng)755 nm下比色，以80%甲醇加顯色劑作參比調(diào)零。以吸光度為縱坐標(biāo)、相對(duì)應(yīng)的綠原酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.002 3x-0.010 4，r2=0.995 9（圖1）。endprint

2.5 加標(biāo)回收率

稱(chēng)取菊花干樣粉末6份，每份0.3 g，按正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，取6支試管，分別加入提取液0.5 mL、60 μg/mL標(biāo)液0.5 mL，定容至5 mL，加0.25 mL顯色劑進(jìn)行顯色，利用分光光度分析加標(biāo)率直接計(jì)算數(shù)學(xué)模型[12]，得出平均回收率為100.83%。

2.6 精密度

對(duì)120 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定20次，測(cè)得樣品中綠原酸吸光度RSD值為0.22%，符合相關(guān)規(guī)定，表明試驗(yàn)精密度很好。

2.7 重復(fù)性

稱(chēng)取5份樣品，每份0.3 g，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取測(cè)定。經(jīng)計(jì)算RSD值為1.10%，表明試驗(yàn)重復(fù)性符合有關(guān)規(guī)定。

3 結(jié)論

與常規(guī)提取方法相比，超聲波提取法具有操作簡(jiǎn)單、溶劑用量少、提取時(shí)間短、對(duì)環(huán)境污染小、被提取活性物質(zhì)不易被破壞、提取率較高等優(yōu)點(diǎn)[13]。酚類(lèi)物質(zhì)與FeCl3發(fā)生顯色反應(yīng)，能夠用來(lái)檢驗(yàn)酚羥基的存在，并對(duì)綠原酸進(jìn)行簡(jiǎn)單快速的定量分析[14]。本試驗(yàn)綜合考慮了與測(cè)定相關(guān)的提取及顯色因子，結(jié)果表明，菊花中綠原酸提取測(cè)定最優(yōu)方法為用80%甲醇作提取劑，超聲提取30 min，加0.02 mol/L FeCl3 0.5 mL 進(jìn)行顯色反應(yīng)，靜置30 min后，在可見(jiàn)分光光度計(jì) 755 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。本方法成本低、簡(jiǎn)便易操作、精密度好、重復(fù)性強(qiáng)，可用于菊花中綠原酸的提取測(cè)定。

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