鴨大腸桿菌與沙門(mén)氏菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李迎曉+安輝+焦鳳超+陳宏智

摘要：利用細(xì)菌分離、生化鑒定及藥敏試驗(yàn)方法，從河南省信陽(yáng)市鴨場(chǎng)病死鴨腦、脾臟中分離出鴨大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌各1株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)頭孢曲松、黏桿菌素、左旋氧氟沙星、恩諾沙星、新霉素高度敏感;對(duì)磺胺甲基異惡唑、潔霉素、強(qiáng)力霉素耐藥。

關(guān)鍵詞：鴨;大腸桿菌;沙門(mén)氏菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn);人工感染試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0224-02

收稿日期：2014-06-04

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：122102110022）。

作者簡(jiǎn)介：李迎曉（1981—），女，河南洛陽(yáng)人，碩士，講師，從事病原微生物與免疫學(xué)研究。E-mail：liyingxiao81@163.com。

鴨大腸桿菌病是由某些致病性大腸桿菌引起的較為常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病。各種年齡的鴨均可感染鴨大腸桿菌病，雛鴨最易感，2～6周齡多發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高，在商品肉鴨中死亡率可高達(dá)50%左右，成年鴨和種鴨則出現(xiàn)零星死亡現(xiàn)象[1]。鴨沙門(mén)氏菌病別稱鴨副傷寒，是由鼠傷寒等幾種沙門(mén)氏菌所引起的疾病總稱，屬一種急性和慢性傳染病，主要引起雛鴨發(fā)病，常呈地方性流行，并可引起大批死亡[2]。2014年3月，養(yǎng)殖戶送檢的表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、腹瀉、脾臟壞死的10日齡病死雛鴨，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)確定為鴨大腸桿菌與鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合感染，本研究將對(duì)混合感染的菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其進(jìn)行藥敏性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、腸桿菌科生化鑒定管、藥敏片、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂、三糖鐵瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自浙江省杭州市天和微生物試劑有限公司;鮮血平板為在營(yíng)養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)上加入5%無(wú)菌羊血配制而成;試驗(yàn)所用的7日齡健康非免疫櫻桃谷肉雛鴨購(gòu)自河南華英集團(tuán)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尸體剖檢 對(duì)病死鴨進(jìn)行尸體剖檢，記錄眼觀病理變化，無(wú)菌采集腦、脾臟、肝臟、心臟病料，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取病死雛鴨腦、脾臟病料并接種于鮮血平板和麥康凱平板上，再分別置于普通培養(yǎng)箱和燭缸中，37 ℃培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色和瑞氏染色后鏡檢;然后挑取單菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面上，37 ℃培養(yǎng)20 h，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3 生化試驗(yàn) 按腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行[3]，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922 為質(zhì)控菌，取適量被檢細(xì)菌的培養(yǎng)物，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，待菌液吸收后，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

1.2.5 人工感染試驗(yàn) 挑取分離菌株純培養(yǎng)物并接種于普通肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，染色鏡檢后4 ℃保存?zhèn)溆?。取未免疫過(guò)疫苗的7日齡健康櫻桃谷鴨作為試驗(yàn)對(duì)象（每組10羽，共30羽）。試驗(yàn)組接種0.5 mL/羽分離菌純培養(yǎng)物，含菌數(shù)約為1.0億CFU，第3組為對(duì)照組，接種等量的生理鹽水。接種后觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢結(jié)果

病死雛鴨外觀消瘦，被毛粗亂，主要表現(xiàn)為脾臟腫大、壞死，肝臟腫大、瘀血，部分病死雛鴨有輕微的肝周炎，腦膜充血。卵黃吸收不良，十二指腸、直腸黏膜充血。

2.2 細(xì)菌分離鑒定

從病死鴨腦和脾臟中分離出2株細(xì)菌，其中1株在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的中等大小菌落;三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基底層變黃，斜面變黃，同時(shí)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣;在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色、具有金屬光澤的菌落;生化鑒定分離菌可引起葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣;靛基質(zhì)、甲基紅、動(dòng)力、產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、棉子糖、山梨醇、木膠糖陽(yáng)性，硫化氫、枸櫞酸鹽、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、尿素、側(cè)金花醇陰性，對(duì)照《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》判定為大腸桿菌。 另1株在麥康凱瓊脂上形成無(wú)色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的中等大小菌落;三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基底層變黑，斜面變紅，同時(shí)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣;在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成無(wú)色菌落;生化鑒定分離菌可引起葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣;賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、硫化氫、枸櫞酸鹽、山梨醇、木膠糖、動(dòng)力和產(chǎn)氣陽(yáng)性，靛基質(zhì)、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、尿素、側(cè)金花醇、甲基紅、棉子糖陰性，對(duì)照《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》判定為鼠傷寒沙門(mén)氏菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B法進(jìn)行，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥物名稱

抑菌圈直徑（mm）

鴨沙門(mén)氏菌 鴨大腸桿菌

磺胺甲基異惡唑 6 5

潔霉素 6 0

黏桿菌素 25 17

左旋氧氟沙星 27 23

丁胺卡那 24 18

氟苯尼考 12 10

頭孢曲松 20 21

慶大霉素 18 14

恩諾沙星 22 24

新霉素 18 19

強(qiáng)力霉素 9 0

注：抑菌圈直徑10 mm 以下為耐藥（不敏感）;10～15 mm 為中度敏感;15 mm 以上為高度敏感。

2.4 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

大腸桿菌試驗(yàn)組接種24 h后，開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)遲緩癥狀，72～120 h全部發(fā)病、部分病鴨死亡。剖檢死鴨有或輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎;沙門(mén)氏菌試驗(yàn)組接種24 h后，開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉癥狀，72 h后全部發(fā)病，部分出現(xiàn)死亡，剖檢死鴨可見(jiàn)肝脾腫大、壞死及腦膜充血。對(duì)死亡鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、染色鏡檢，結(jié)果與前期指標(biāo)符合。

3 結(jié)論與討論

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)頭孢曲松、黏桿菌素、左旋氧氟沙星、恩諾沙星和新霉素高度敏感;對(duì)氟苯尼考中敏;對(duì)磺胺甲基異惡唑、潔霉素和強(qiáng)力霉素耐藥。這和當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶喜歡使用氟苯尼考+強(qiáng)力霉素或復(fù)方磺胺的用藥方案有關(guān)。而分離菌雖然對(duì)左旋氧氟沙星和恩諾沙星高度敏感，但由于鴨群在使用氟喹諾酮類(lèi)藥物以后，若劑量掌握不好，容易發(fā)生光敏作用而導(dǎo)致鴨群發(fā)生“喙畸形或變形”，因此養(yǎng)殖戶使用這些藥物比較謹(jǐn)慎。可見(jiàn)，定期開(kāi)展常見(jiàn)病原菌的耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)于指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥具有重要意義。

鴨大腸桿菌病和鴨沙門(mén)氏菌病是雛鴨常發(fā)病，具有較高的發(fā)病率和死亡率。信陽(yáng)市是河南省主要的水禽集散地，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖品種的復(fù)雜化，以及種源病原凈化不徹底等因素，當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖環(huán)境特別是水體環(huán)境逐漸惡化，再加上飼養(yǎng)管理不規(guī)范、抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致鴨大腸桿菌病、鴨沙門(mén)氏菌病和鴨疫里氏桿菌病等疾病的發(fā)生呈現(xiàn)常態(tài)化、復(fù)雜化。而一些新發(fā)傳染病如鴨脾壞死癥在實(shí)驗(yàn)室接診的病例中出現(xiàn)的比例不斷擴(kuò)大，更增加了疾病診斷和防控的難度[4]。綜合以上因素，雛鴨大腸桿菌病、沙門(mén)氏菌病等傳染病的防治有賴于潔凈的種源、規(guī)范的飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)管理措施、血清型對(duì)應(yīng)的免疫接種程序以及規(guī)范的藥物使用制度。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣新華，張文波，熊莉娟，等. 一株鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥分析[J]. 中國(guó)家禽，2012，34（5）：20-22.

[2]陳伯倫. 鴨病[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[3]桂炳東，孫 敬，徐建民.細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定手冊(cè)[M]. 南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

[4]丁孟建，陳 績(jī)，趙青劍，等. 雛鴨沙門(mén)氏菌病病原分離鑒定及耐藥性檢測(cè)[J]. 中國(guó)家禽，2013，35（11）：45-46.endprint