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    硫酸卡那霉素注射液含量測(cè)定的不確定度分析

    2015-06-09 22:01:15于麗娜徐嫄韓寧寧趙暉郝利華
    中國(guó)獸藥雜志 2015年2期
    關(guān)鍵詞:卡那霉素移液管量瓶

    于麗娜,徐嫄,韓寧寧,趙暉,郝利華

    (中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

    硫酸卡那霉素注射液含量測(cè)定的不確定度分析

    于麗娜,徐嫄,韓寧寧,趙暉,郝利華

    (中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

    為研究微生物檢定法(管碟法)測(cè)定硫酸卡那霉素注射液生物效價(jià)試驗(yàn)中各因素對(duì)結(jié)果的影響,采用不確定度分析,將影響因素歸納為稱(chēng)量、稀釋、加樣、測(cè)定、平行試驗(yàn),量化各不確定度分量,評(píng)估各因素的影響因子。結(jié)果表明,牛津杯加樣體積對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最大,提示試驗(yàn)中應(yīng)盡可能精確控制加樣體積。

    微生物檢定法;硫酸卡那霉素注射液;效價(jià);不確定度

    目前,國(guó)際上通用的抗生素微生物檢定法包括管碟法和濁度法。管碟法,又稱(chēng)杯碟法,是各國(guó)(獸)藥典收載的經(jīng)典抗生素微生物檢定通用方法。管碟法操作步驟繁多,如何評(píng)估各操作步驟對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,從而提高管碟法的準(zhǔn)確度是目前抗生素分析工作者所關(guān)心的問(wèn)題之一。不確定度分析[1]通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)引入的不確定度進(jìn)行評(píng)估,可分析各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。目前廣泛通用的不確定度評(píng)定模型是來(lái)自由ISO、IEC等七個(gè)國(guó)際組織聯(lián)合發(fā)布的《測(cè)量不確定度評(píng)估指南》[2]中的模型,也是國(guó)際上第一個(gè)取得一致認(rèn)同的模型。根據(jù)《JJF1059.1-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[3],本文對(duì)微生物檢定法(管碟法)測(cè)定硫酸卡那霉素注射液生物效價(jià)的不確定度進(jìn)行了分析和評(píng)估。

    1 儀器與試藥

    CHB-1抗生素效價(jià)測(cè)量?jī)x(北京潮聲技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);AX-205分析天平(瑞士Sartorius公司);恒溫培養(yǎng)室;硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(USP標(biāo)準(zhǔn)品,775單位/mg,批號(hào):35500J)與硫酸卡那霉素注射液供試品(某市售產(chǎn)品,規(guī)格10 mL∶1.0 g(100萬(wàn)單位);Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基(批號(hào)131105);枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所);磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀等試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液的制備 取供試品3支,混合均勻,精密量取5mL,置50mL量瓶中,用滅菌水稀釋至刻度,精密量取該溶液5mL,置50mL量瓶中,用滅菌水稀釋至刻度,搖勻,制成每1mL中約含1000單位的溶液。精密量取該溶液(1000單位/mL)5 mL,置50 mL量瓶中,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中約含100單位的溶液;再分別吸取該溶液(100單位/mL)2.00 mL,分置50 mL、100 mL量瓶中,分別用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度,搖勻,得到濃度分別為4單位/mL和2單位/mL的溶液,作為供試品溶液的高、低劑量。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品32.26 mg,置25 mL量瓶中,加滅菌水溶解并稀釋至刻度,制成每1 mL中約含1000單位的溶液,稀釋同供試品溶液制備項(xiàng)下,自“精密量取該溶液(1000單位/mL)……”起,同法操作。

    2.3 雙碟的制備與培養(yǎng) 取平底雙碟約7套(n),分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL,放置水平臺(tái)上使凝固,作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量,放冷至60℃,加入枯草芽孢桿菌的菌懸液適量,搖勻,在每一雙碟中分別加入5 mL,攤布均勻,作為菌層。冷卻后,在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4(k)個(gè),待用。將上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi),在35~37℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)14~16 h。

    2.4 抑菌圈直徑的測(cè)定與效價(jià)計(jì)算 取出培養(yǎng)好的雙碟,用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑,照生物檢定統(tǒng)計(jì)法[4]進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算。當(dāng)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果才成立。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果

    3 測(cè)量不確定度評(píng)估

    3.1 數(shù)學(xué)模型 效價(jià)由下式給出:

    式中,P為供試品效價(jià)(相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分含量),S2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致的各抑菌圈直徑(面積)的總和,S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致的各抑菌圈直徑(面積)的總和,T2為供試品高濃度溶液所致的各抑菌圈直徑(面積)的總和,T1為供試品低濃度溶液所致的各抑菌圈直徑(面積)的總和,I為高、低劑量之比的對(duì)數(shù),當(dāng)劑量比為2∶1時(shí),I=log2/1=0.3010,與所用碟數(shù)無(wú)關(guān)。

    3.2 不確定度來(lái)源分析 對(duì)抗生素微生物檢定法(管碟法)二劑量法的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析,主要分為可直接估算的不確定度和不可直接估算的不確定度??芍苯庸浪愕牟淮_定度有:稱(chēng)量、稀釋、加樣、測(cè)定、平行試驗(yàn)。不可直接估算的不確定度有:標(biāo)準(zhǔn)品純度、加樣時(shí)間、培養(yǎng)溫度。

    3.3 可直接估算的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    3.3.1 測(cè)量過(guò)程引入的不確定度

    3.3.1.1 抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量u測(cè)量(1) 在二劑量法中,由于每份測(cè)定報(bào)告都是由N個(gè)培養(yǎng)皿組成,抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量為實(shí)際測(cè)量中供試品重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)抑菌圈直徑的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算效價(jià)(y)為101.54單位/mg,同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析得自由度f(wàn)=(k-1)(n-1)=18,其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    3.3.1.2 抑菌圈測(cè)量?jī)x的不確定度分量u測(cè)量(2)自檢報(bào)告顯示,抑菌圈測(cè)量?jī)x的最大允許誤差為±0.03 mm,則區(qū)間半寬度αP=0.03 mm,測(cè)量值落在該區(qū)間的概率分布為均勻分布,標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/3=0.017 mm;抑菌圈測(cè)量?jī)x的標(biāo)準(zhǔn)圈直徑為19 mm,則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    3.3.2 加樣過(guò)程引入的不確定度 在本實(shí)驗(yàn)中,采用定量移液器向牛津杯中滴加抗生素溶液,加樣體積的不確定度來(lái)自于:①定量移液器的系統(tǒng)允差;②定量移液器重復(fù)量取偏差;③溫度校正引入的不確定度。

    由廠商提供的信息可知,1 mL定量移液器的系統(tǒng)允差為±3.0%,則使用定量移液器量取0.27 mL液體的系統(tǒng)允差為±0.0081 mL,按矩形分布估計(jì),標(biāo)準(zhǔn)偏差為:0.0081/3=0.00468mL;使用定量移液器重復(fù)量取10次,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00372 mL;定量移液器應(yīng)在23℃校準(zhǔn),量取抗生素溶液時(shí)溫度為25℃,與校準(zhǔn)溫度有2℃的溫差,在95%的置信區(qū)間下,按均勻分布計(jì),則標(biāo)準(zhǔn)偏差為

    因此,使用定量移液器滴加抗生素溶液時(shí),由加樣體積引入的合成不確定度為:

    3.3.3 溶液配制引入的不確定度

    3.3.3.1 量瓶、移液管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 根據(jù)《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》[5]查得,A級(jí)100 mL、50 mL、25 mL單標(biāo)線容量瓶的允許誤差分別為:±0.10 mL、±0.05 mL、±0.03 mL,以B類(lèi)不確定度計(jì)算,按三角分布估計(jì),則標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為:0.10/6=0.0408mL,0.05/6=0.0204mL,0.03/6=0.0122mL;A級(jí)5mL和2 mL移液管最大允差分別為0.015 mL和0.010 mL,按B類(lèi)不確定度評(píng)定,假定為三角形分布,則標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為:0.015/6=0.006 mL,0.010/6=0.004 mL;配制溶液時(shí),實(shí)驗(yàn)室溫度接近15℃,容量器皿校準(zhǔn)溫度為23℃,在95%的置信區(qū)間下,按均勻分布計(jì),則標(biāo)準(zhǔn)偏差為±2.5×2.1× 10-4×8/3=0.0024 mL;因此,100 mL量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:3.3.3.2 溶液配制的不確定度us(稀釋?zhuān)?標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程中分別使用100 mL(V?1)、50 mL(V?2)、25 mL(V?1)量瓶,5 mL移液管(V?1)、2 mL移液管(V?1),則如公式(1)。

    供試品溶液配制過(guò)程中分別使用100mL(V?1)、50 mL(V?4)量瓶,5 mL移液管(V?1)、2 mL移液管(V?1),則如公式(2)。

    3.3.4 稱(chēng)量/取樣引入的不確定度

    3.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品取樣引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)品為固體,采用稱(chēng)量取樣,不確定度主要來(lái)自于:①稱(chēng)量偏差;②天平校正偏差。

    (1)稱(chēng)量偏差:使用天平對(duì)同一質(zhì)量恒定的物體(1 g,標(biāo)準(zhǔn)砝碼)反復(fù)稱(chēng)量10次,其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0099 mg。

    (2)天平校正偏差:天平(AX205,d=0.01 mg)檢定證書(shū)標(biāo)明其最大允差為0.10 mg,按矩形分布估計(jì),校準(zhǔn)不確定度為0.10=0.0577mg,上述分量必須計(jì)3

    算2次,一次作為空盤(pán),一次作為毛重,因?yàn)槊看畏Q(chēng)量均為獨(dú)立的觀測(cè)結(jié)果,兩者的線性影響不相關(guān),因此

    則標(biāo)準(zhǔn)品取樣的合成不確定度為:3.3.4.2 供試品取樣引入的不確定度 供試品為注射劑,采用5 mL移液管取樣,如前述,不確定度uT(取樣)為0.0013。

    3.3.5 平行試驗(yàn)引入的不確定度uc(平行) 根據(jù)《獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)程》“HYZY081-2011化學(xué)原料藥和制劑的含量測(cè)定法”規(guī)定,含量(效價(jià))測(cè)定至少平行測(cè)定兩份。因此,平行量取供試品2份,同時(shí)操作,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,取兩次測(cè)定的平均值作為硫酸卡那霉素效價(jià)的測(cè)定結(jié)果,采用極差法對(duì)平行測(cè)定引入的不確定度進(jìn)行評(píng)估。

    表2 注射用硫酸卡那霉素平行測(cè)定結(jié)果

    式中,A為1號(hào)供試品測(cè)得的效價(jià)比值;B為2號(hào)供試品測(cè)得的效價(jià)比值。

    3.4 總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(x)rel

    3.5 擴(kuò)展不確定度U 將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以一個(gè)給定概率的包含因子(k),得到擴(kuò)展不確定度[6]。本文采用置信概率為95%的包含因子(k95),根據(jù)t分布表,取k=2,則擴(kuò)展不確定度為:u(x)/x=0.024,x=10.09萬(wàn)單位/mL,u(x)=0.024× 10.09萬(wàn)單位/mL=0.24萬(wàn)單位/mL。取k=2,則擴(kuò)展不確定度為U=2u(x)=2×0.24萬(wàn)單位/mL=0.48萬(wàn)單位/mL。

    硫酸卡那霉素效價(jià)測(cè)定的結(jié)果可表示為:(10.09±0.48)萬(wàn)單位/mL(95%置信限)。

    4 討論與小結(jié)

    按照《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[7],二劑量法加樣順序?yàn)椋焊邼舛葮?biāo)準(zhǔn)品溶液→高濃度供試品溶液→低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液→低濃度供試品溶液,每次滴加的溶液應(yīng)為同一濃度,雙碟數(shù)不超過(guò)5個(gè),如樣品溶液滴加雙碟數(shù)目多,可分組滴加。對(duì)于不同的操作者而言,加樣方法略有不同。由加樣時(shí)間引入的不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響為系統(tǒng)誤差,在試驗(yàn)中,應(yīng)盡量減少加樣時(shí)間,以將該因素的影響控制在最小,在不確定度分析中做零項(xiàng)處理[8]。恒溫培養(yǎng)室大小約為3m×1.5m,房間密閉,同時(shí)布有溫度檢測(cè)探頭,溫度區(qū)間為35~37℃,通過(guò)長(zhǎng)期觀察記錄,溫度可穩(wěn)定在35~37℃,因此,培養(yǎng)溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可忽略不計(jì)。

    綜上所述,各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果影響如下:加樣體積>平行試驗(yàn)>供試品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制>標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量>抑菌圈重復(fù)測(cè)量>抑菌圈測(cè)量?jī)x>供試品取樣。由此可見(jiàn),當(dāng)供試品為液體時(shí),采用移液管取樣,供試品取樣引入的不確定度最小,儀器引入的不確定度次之,而牛津杯中的加樣體積,則是影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素。本文為分析微生物檢定法(管碟法)測(cè)定抗生素生物效價(jià)不確定度提供了可靠的方法,并為如何提高抗生素效價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度提供了參考依據(jù)。

    [1] 劉建坤,朱家平,鄭榮.測(cè)量不確定度評(píng)定研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2013,10(5):12-17.

    [2] ISO 1993(E).Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement[S].

    [3] JJF1059.1-2012.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].

    [4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典一部[S].2010年版.

    [5] JJF1059.1-2012.玻璃儀器檢定規(guī)程[S].

    [6] 粟曉黎,李冠民,金少鴻.藥品檢驗(yàn)一般檢測(cè)項(xiàng)目不確定度評(píng)定研究-1.B類(lèi)評(píng)定[J].藥物分析雜志,2005,25(6):699-705.

    [7] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

    [8] 常艷.抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的定值及其不確定度評(píng)定[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院,2011.

    (編輯:李文平)

    Evaluation of Uncertainty of Determ ination of Kanam ycin M onosulfate for Injection by the M icrobiological M ethod

    YU Li-na,XU Yuan,HAN Ning-ning,ZHAO Hui,HAO Li-h(huán)ua
    (China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081,China)

    To evaluate the uncertainty of determination of kanamycin monosulfate for injection by the microbiological method in Chinese Veterinary Pharmacopoeia(edition 2010),a mathematied model was established to evaluate the factors affecting sample determination.Each componentof uncertainty was calculated by analyzing the various variable parameters among the procedures.The combined uncertainty was finally obtained by synthesizing the uncertainties of various component variables.The volume of sample added into Oxford Cup effects resultmost.As a result,the added volume should be controlled accurately in the test.

    microbiologicalmethod;kanamycin monosulfate for injection;biological value;uncertainty evaluation

    2014-11-24

    A

    1002-1280(2015)02-0040-04

    S859.79

    于麗娜,碩士,從事藥物分析及檢驗(yàn)工作。E-mail:yulinachina@163.com

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