水環(huán)境中致病微生物活的非可培養(yǎng)狀態(tài)研究進(jìn)展

陳亨利，陳龍，康元環(huán)，莫金龍，單曉楓，李影

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118）

水環(huán)境中致病微生物活的非可培養(yǎng)狀態(tài)研究進(jìn)展

陳亨利，陳龍，康元環(huán)，莫金龍，單曉楓?，李影?

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118）

細(xì)菌的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）”是指細(xì)菌在不良環(huán)境下形成的一種特殊狀態(tài)。常規(guī)檢測(cè)方法不能檢測(cè)出此狀態(tài)下的細(xì)菌，給食品安全、公共衛(wèi)生帶來了隱患?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的VBNC狀態(tài)細(xì)菌大多數(shù)是水生細(xì)菌，包括很多種致病菌?，F(xiàn)對(duì)近些年水環(huán)境中致病微生物VBNC狀態(tài)的形成與檢測(cè)、生物學(xué)特性及復(fù)蘇的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，希望能夠?qū)BNC狀態(tài)水生致病微生物引起疾病的防治起到積極作用。

活的非可培養(yǎng)狀態(tài)；水環(huán)境中致病微生物；檢測(cè)方法；生物學(xué)特性

活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non－culturable state，VBNC），即細(xì)菌在不良環(huán)境條件下，細(xì)胞縮小成球形，常規(guī)培養(yǎng)方法不能生長(zhǎng)繁殖，但仍具有代謝活性，并且在一定條件下能夠復(fù)蘇的特殊存活形式。許多革蘭氏陰性菌（G－）和一些不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌（G＋）在不利于生長(zhǎng)的條件下都可能進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。

弧菌屬和氣單胞菌屬細(xì)菌是常見的水環(huán)境致病微生物，其中很多種都能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)。常規(guī)方法不能檢測(cè)出進(jìn)入VBNC的細(xì)菌，在此狀態(tài)下細(xì)菌仍保持著潛在的致病力［1］。因此魚塘中若存在VBNC細(xì)菌，條件適當(dāng)時(shí)會(huì)發(fā)生相應(yīng)水產(chǎn)疾病從而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失甚至危害人類生命健康。

一些學(xué)者已經(jīng)開始關(guān)注VBNC狀態(tài)細(xì)菌對(duì)公共衛(wèi)生的影響［1］，近年來分子生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的應(yīng)用與完善，推動(dòng)了這一領(lǐng)域的研究。研究VBNC狀態(tài)對(duì)公共衛(wèi)生、流行病學(xué)、微生態(tài)學(xué)等學(xué)科有著重要意義。本文對(duì)近年來水環(huán)境中致病微生物的VBNC狀態(tài)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 活的非可培養(yǎng)狀態(tài)概述

1982年徐懷恕等［2］通過研究霍亂弧菌（Vibrio cholerae）和大腸埃希菌（Escherichia coli）的存活規(guī)律而首次提出了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)這一概念。在VBNC狀態(tài)被報(bào)道之前，人們普遍認(rèn)為細(xì)菌不再生長(zhǎng)繁殖即為死亡狀態(tài)。而VBNC狀態(tài)的致病菌仍具有潛在的致病性，在適當(dāng)條件下能夠復(fù)蘇，復(fù)蘇后仍然具有毒力［3］。至今已有報(bào)道的20個(gè)屬的60多種細(xì)菌能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)［4］，許多水環(huán)境中的致病微生物都存在VBNC這一特殊狀態(tài)，如殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、殺魚巴斯德氏菌（Pasteurella piscida）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、熒光假單胞菌（Pseudomonadaceae Fluorescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonadaceae Putida）、遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）等（表1）。許多研究人員正應(yīng)用不同水環(huán)境致病菌進(jìn)行VBNC實(shí)驗(yàn)，以期發(fā)現(xiàn)更多能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。

表1 常見能夠進(jìn)入VBNC的水環(huán)境致病菌種類［4］

2 水環(huán)境中致病微生物VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

細(xì)菌世代中會(huì)受到許多環(huán)境方面的壓力，使細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N類似休眠的特殊狀態(tài)，即VBNC狀態(tài)。Wolf和Oliver報(bào)導(dǎo)了細(xì)菌在包括低溫、寡營(yíng)養(yǎng)和不同滲透壓等各種環(huán)境壓力下能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)［5］。不同細(xì)菌進(jìn)入VBNC需要的環(huán)境條件不盡相同，通常細(xì)菌處于不利于生長(zhǎng)的環(huán)境下更容易進(jìn)入VBNC狀態(tài)［6］。溫度和寡營(yíng)養(yǎng)條件是誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的主要因素。

2.1 溫度 溫度是影響細(xì)菌進(jìn)入VBNC的重要因素之一，且常常伴有其他方面如營(yíng)養(yǎng)條件的協(xié)同作用。大多數(shù)細(xì)菌，如弧菌，對(duì)低溫度較敏感［7］，僅有少部分細(xì)菌在較高溫度下能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)，Rollins和Colwell［8］對(duì)空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）的研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌在30℃條件下比在4℃條件下更快地進(jìn)入VBNC狀態(tài)，Rahman等［9］通過對(duì)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的研究，發(fā)現(xiàn)25℃時(shí)的細(xì)菌存活數(shù)量比5℃要多。然而水環(huán)境中致病菌通常于30℃條件下培養(yǎng)，低溫對(duì)這些細(xì)菌的影響相對(duì)較弱，有些細(xì)菌如維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）甚至在4℃環(huán)境下仍能緩慢生長(zhǎng)。這證明不是所有水環(huán)境中致病菌都會(huì)在低溫誘導(dǎo)條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)，還有一部分細(xì)菌如溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等，溫度對(duì)它們的影響較小。

2.2 營(yíng)養(yǎng)條件 通常細(xì)菌在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間得不到充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，便有可能會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)。低溫度與寡營(yíng)養(yǎng)共同作用會(huì)加速促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。Rahman等［9］將嗜水氣單胞菌于25℃，0.35%的NaCl溶液中培養(yǎng)50 d進(jìn)入VBNC狀態(tài)。潘高山等［10］用湖水在室溫下培養(yǎng)溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），僅4 d后就有90%的細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。上述研究表明，當(dāng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平低下時(shí)，水環(huán)境中致病菌會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)以保持自身代謝活性。

2.3 其他因素 通常鹽度或滲透壓對(duì)腸道菌群影響較明顯，而對(duì)水生細(xì)菌影響相對(duì)較弱。光照和輻射會(huì)對(duì)水生致病菌產(chǎn)生一定的影響，但也與細(xì)菌種類有關(guān)，如Hoff等［11］的研究中，光對(duì)海水中的殺鮭弧菌（Vibrio salmonicida）及鰻弧菌（Vibrio anguillarum）沒有明顯影響。

3 水環(huán)境中致病微生物VBNC狀態(tài)的檢測(cè)

目前對(duì)VBNC細(xì)菌的檢測(cè)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而利用平板計(jì)數(shù)法觀測(cè)可培養(yǎng)菌數(shù)是檢測(cè)的第一步。通過平板計(jì)數(shù)法確定可培養(yǎng)菌落數(shù)為零時(shí)，再根據(jù)以下方法對(duì)細(xì)菌是否進(jìn)入VBNC狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。

3.1 活菌直接技術(shù)法 要檢測(cè)VBNC菌，首先要確定活菌數(shù)，只有可培養(yǎng)數(shù)為零而活菌數(shù)不為零的細(xì)菌才存在VBNC狀態(tài)?；罹苯佑?jì)數(shù)法（direct viable counting，DVC）是目前常用的檢測(cè)方法之一。利用萘啶酮酸——一種DNA多聚酶抑制劑，刺激待檢菌液，由于DNA合成受到萘啶酮酸的抑制，菌液中的活菌只能生長(zhǎng)而不能分裂。將萘啶酮酸添加入細(xì)菌培養(yǎng)物中，培養(yǎng)6 h后進(jìn)行吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察，可觀察到活細(xì)菌變長(zhǎng)，而VBNC狀態(tài)的細(xì)胞是橢圓形的［12］。

3.2 熒光顯微鏡檢測(cè) 熒光顯微鏡的一種快速檢測(cè)方法是使用LIVE／DEAD試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。LIVE／DEAD試劑盒基于細(xì)胞膜的完整性進(jìn)行檢測(cè)，其中包含兩種熒光染料：SYTO－9和碘化丙啶（PI）。SYTO－9能夠滲透進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，將核酸染色，激發(fā)出綠色熒光；PI只能滲入破損的細(xì)胞膜，將核酸染色后激發(fā)出紅色熒光。在落射熒光顯微鏡鏡下，發(fā)出綠色熒光的為活細(xì)菌，發(fā)出紅色熒光的為死細(xì)菌［13］。此方法簡(jiǎn)便快速，使用范圍廣泛，并且可配合流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè) 分子生物學(xué)方法具有很高的靈敏性和特異性，如果有適當(dāng)?shù)奶禺愋砸铮湍軌驅(qū)颖局械募?xì)菌DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，這種方法不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，能夠判斷不能進(jìn)行培養(yǎng)的樣本中是否有細(xì)菌存在，然而卻不能檢測(cè)出細(xì)菌是否存活。相對(duì)于細(xì)菌的DNA，mRNA的半衰期非常短，僅有2～3min，因此可以用基于mRNA的檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行VBNC的判斷，可靠性很高。2012年潘樂等［14］利用RT－qPCR建立了VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)方法，結(jié)果顯示良好。Gary等［15］應(yīng)用RT－PCR聯(lián)合芯片雜交技術(shù)對(duì)弧菌的stx1基因進(jìn)行VBNC檢測(cè)，結(jié)果表明此方法靈敏性、可靠性均較好。

3.4 基于細(xì)胞呼吸的檢測(cè)方法 判斷細(xì)菌是否為VBNC狀態(tài)的其他方法還有利用細(xì)菌的氧化還原能力進(jìn)行檢測(cè)，5－氰基－2，3－二（4－甲基苯基）四唑氯化物（5－cyano－2，3－ditolyl tetrazolium chloride，CTC）是一種電子受體物質(zhì)，細(xì)菌的呼吸過程能夠使無色的CTC還原為紅色。將一定濃度的CTC添加至細(xì)菌培養(yǎng)物中，避光條件下室溫培養(yǎng)，顯微鏡觀察或應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，能夠看到具有紅色熒光的細(xì)菌即為活細(xì)菌［16］。此方法操作簡(jiǎn)便，但所有細(xì)菌是否都能降解CTC還不清楚［17］。

4 VBNC狀態(tài)水環(huán)境中致病微生物的生物學(xué)特性

4.1 VBNC時(shí)細(xì)菌形態(tài)變化 大多數(shù)進(jìn)入VBNC的細(xì)菌都會(huì)發(fā)生程度不一的形態(tài)改變。且通常桿菌和弧菌會(huì)變短呈球桿狀甚至變?yōu)榍驙?。雖然細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生了變化，但細(xì)菌結(jié)構(gòu)沒有改變，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、外膜仍然完整，并具有正常狀態(tài)下的表面蛋白、毒力因子。極少數(shù)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后細(xì)胞完整性被破壞，Chiu等［18］觀察到黃色熒光蛋白（YFP）標(biāo)記的副溶血弧菌骨架蛋白MreB在細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后降解為小片段。Zhong等［19］用透射電鏡觀察VBNC狀態(tài)的辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnariens）發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜和外膜之間出現(xiàn)了較大空隙。杜萌等［20］在雞胚尿囊腔中成功復(fù)蘇了VBNC的遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），并用電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后的細(xì)菌形態(tài)與正常細(xì)菌沒有區(qū)別。上述研究表明當(dāng)細(xì)菌復(fù)蘇后，其形態(tài)能夠恢復(fù)正常。

4.2 耐藥性 Ben等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，正常、VBNC狀態(tài)和復(fù)蘇后的河流弧菌，藥敏試驗(yàn)的結(jié)果幾乎一致。同樣地，其他一些學(xué)者對(duì)VBNC狀態(tài)的細(xì)菌研究證明正常細(xì)菌和VBNC狀態(tài)下以及復(fù)蘇后的細(xì)菌其耐藥性方面并無差異［22－23］。

4.3 致病性 進(jìn)入VBNC的細(xì)菌會(huì)保留一部分毒力因子，因此有著潛在的毒力，復(fù)蘇后便會(huì)表達(dá)而發(fā)生疾病。有的細(xì)菌甚至在VBNC狀態(tài)仍具有致病性。Saux等［24］應(yīng)用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)VBNC狀態(tài)下的創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），檢測(cè)到了溶血毒素基因的mRNA，說明在VBNC狀態(tài)下溶血毒素基因仍在表達(dá)。Ben等［25］對(duì)溶藻弧菌的研究發(fā)現(xiàn)VBNC狀態(tài)下的溶藻弧菌具有致病性。鐘琳紅等［26］用RT－PCR檢測(cè)VBNC狀態(tài)哈維氏弧菌絲氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在VBNC狀態(tài)哈維氏弧菌未表達(dá)這兩種基因，而正常及復(fù)蘇后的細(xì)胞均能檢測(cè)到此兩種基因的表達(dá)，從而推斷這可能是哈維氏弧菌能長(zhǎng)期保持致病性并持續(xù)爆發(fā)疾病的原因之一。

5 VBNC狀態(tài)水環(huán)境中致病微生物的復(fù)蘇

如果細(xì)菌的VBNC狀態(tài)是其維持生命的一種應(yīng)答機(jī)制，那么VBNC狀態(tài)的細(xì)菌應(yīng)該是能夠復(fù)蘇的。通常認(rèn)為想要使VBNC狀態(tài)的細(xì)菌復(fù)蘇需要恢復(fù)適宜細(xì)菌生存的環(huán)境。有些細(xì)菌如弧菌僅僅使溫度上升就能夠使其恢復(fù)可培養(yǎng)能力，有些細(xì)菌則需要其他條件如添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，解除滲透壓等，或?qū)⒎强膳囵B(yǎng)細(xì)菌導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇。Thomas等［27］將VBNC狀態(tài)的希利氏弧菌（Vibrio shiloi）和塔斯馬尼亞弧菌（Vibrio tasmaniensis）的培養(yǎng)條件恢復(fù)至20℃，兩種細(xì)菌均恢復(fù)了可培養(yǎng)能力；Morris等［28］將原綠球菌（Prochlorococcus）置于富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境時(shí)，可迅速生長(zhǎng)；Baffone等［29］利用Balb／C小鼠作為宿主，成功復(fù)蘇了溶藻弧菌和哈維氏弧菌等海洋弧菌。此外，有些VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇并不是一步完成的，Ben等［21］將VBNC狀態(tài)6年的河流弧菌進(jìn)行復(fù)蘇，經(jīng)過48 h培養(yǎng)后僅恢復(fù)了β－半乳糖苷酶和氧化酶活性，而繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月后才恢復(fù)了正常河流弧菌的全部生物活性，并且復(fù)蘇后的細(xì)菌各種特性均與原菌相同。

但是，對(duì)于細(xì)菌是否為VBNC狀態(tài)復(fù)蘇生長(zhǎng)抑或剩余可培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)而成，目前還存在一些爭(zhēng)論。Jiang等［30］通過對(duì)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）升溫復(fù)蘇的研究認(rèn)為，所謂的復(fù)蘇其實(shí)是殘存的可培養(yǎng)細(xì)菌重新開始生長(zhǎng)；而Whiteside等［31］經(jīng)過一系列稀釋、細(xì)菌重新生長(zhǎng)時(shí)間及添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等試驗(yàn)綜合分析，認(rèn)為創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）確實(shí)存在著復(fù)蘇的現(xiàn)象。但由于VBNC狀態(tài)的復(fù)蘇機(jī)理尚不清楚，因此不同細(xì)菌復(fù)蘇條件不盡相同，甚至有些VBNC細(xì)菌還沒有成功復(fù)蘇的報(bào)道。1998年Mukamolova等［32］在藤黃微球菌的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了一種復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation－promoting factor，Rpf），這一發(fā)現(xiàn)可能是研究VBNC狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇的關(guān)鍵，但在水生致病微生物領(lǐng)域鮮有應(yīng)用Rpf進(jìn)行復(fù)蘇的報(bào)道。

6 研究VBNC狀態(tài)對(duì)水環(huán)境中致病微生物檢測(cè)的意義及展望

VBNC狀態(tài)的水環(huán)境中致病菌在適當(dāng)條件下能夠轉(zhuǎn)變成為正常細(xì)菌，并恢復(fù)其致病力。而常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)不出處于這種特殊狀態(tài)的致病微生物，這就為病原的檢測(cè)、疾病的起因和防治研究提供了新的思路。例如當(dāng)檢測(cè)魚塘中病原菌時(shí)，不僅要用傳統(tǒng)檢測(cè)方法來檢測(cè)，同時(shí)還應(yīng)利用新興的VBNC病原菌檢測(cè)技術(shù)，以免一些細(xì)菌逃脫檢測(cè)而造成未來可能發(fā)生的疾病流行。

細(xì)菌VBNC狀態(tài)的出現(xiàn)，對(duì)食品安全、公共健康帶來了新的挑戰(zhàn)，能否檢測(cè)出VBNC狀態(tài)下的水環(huán)境中致病微生物，關(guān)系到人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全。而在環(huán)境中，應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)手段只能夠檢測(cè)出環(huán)境總病原菌中的小部分，而大多數(shù)細(xì)菌是以VBNC狀態(tài)存活，不能夠直接檢測(cè)出病原菌，因而給漁業(yè)帶來了隱患。研究細(xì)菌的VBNC狀態(tài)機(jī)制，能夠加深人們對(duì)細(xì)菌的了解，有利于進(jìn)一步制定有效殺滅病原菌的措施。

VBNC狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)對(duì)微生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)來講也是一種機(jī)遇，近年來抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）越來越多地應(yīng)用于VBNC狀態(tài)基因差異的分析中，李文博等［33］應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，對(duì)鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）進(jìn)行了VBNC的鑒定，同樣地，這種技術(shù)也可以應(yīng)用于水環(huán)境中致病微生物的VBNC檢測(cè)中。希望在不遠(yuǎn)的將來，種種VBNC的檢測(cè)技術(shù)能夠發(fā)展成熟，從而在上市前的質(zhì)檢環(huán)節(jié)斷絕VBNC狀態(tài)水生致病菌的隱性污染，為食品公共安全提供有力的技術(shù)保障。

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（編輯：陳希）

Progress in Research on Viable but Non －culturable State of Pathogenic M icroorganism in W ater Environment

CHEN Heng－li，CHEN Long，KANG Yuan－h(huán)uan，MO Jin－long，SHAN Xiao－feng?，LIYing?
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Bacteriamay form the exceptional and“viable but non－culturable（VBNC）”state under themalnourished environment.The VBNC state of bacteriamay notbe detected by conventional detectionmethod，bringing hazards to the food safety and public health.Most of the VBNC bacteria which have been discovered now are commonly aquatic bacteria，including many kinds of pathogenic bacteria.This paper describes the research of formation，detection，biological characteristics and recovery of pathogenic microorganism in water environment，which may play a positive role in prevention and control of diseases caused by the VBNC state of pathogenic microorganism.

viable but non－culturable；pathogenicmicroorganism in water environment；detectionmethod；biological characteristics

??杜萌.幾種常見致病菌的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)研究［D］.中國(guó)海洋大學(xué)，2007.

10.7666／d.y1112118.

2014－12－08

A

1002－1280（2015）02－0052－06

S852.6

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201927）

陳亨利，碩士，從事動(dòng)物微生物學(xué)研究工作。

李影，E－mail：thliying＠163.com；單曉楓，E－mail：sxf1997＠163.com