超高效及高效液相色譜法測(cè)定華法林鈉片含量的結(jié)果比對(duì)

丁大中，宋梓瑜，于 毓

(山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 青島 266071)

華法林鈉為雙香豆素的衍生物，臨床應(yīng)用廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是作用強(qiáng)且穩(wěn)定、可口服給藥、應(yīng)用方便、價(jià)廉且作用持久[1－2]。目前，進(jìn)口華法林鈉片采用《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》[3]檢驗(yàn)，含量測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)法。超高效液相色譜(UPLC)法比HPLC法具有高效、快速、靈敏度和分辨率高、微量、經(jīng)濟(jì)及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[4－8]，但將其用于華法林鈉含量測(cè)定還未見報(bào)道。本研究參考文獻(xiàn)[9－12]，成功建立了測(cè)定華法林鈉片含量的UPLC法，該方法操作靈敏、準(zhǔn)確，且能實(shí)現(xiàn)高通量的分析樣品。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(包含Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司);AG285型十萬(wàn)分之一天平(瑞士 Mettler Toledo公司);超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。華法林鈉對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為101163－201001，含量為92.3%);磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20120104)、甲醇(德國(guó)Merch公司)、乙腈(德國(guó)Merch公司)均為色譜純;超純水(Millipore超純水儀公司);華法林鈉片(芬蘭Orion Corparation公司，規(guī)格為每片 3 mg，批號(hào)分別為 1555638，1555639，1556716，1556720，1556722)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HPLC色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以水(磷酸調(diào) pH 至 3.0)為流動(dòng)相 A、乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫;流速1.5 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量 20 μL。

UPLC色譜條件:色譜柱為Thermo Syncronis C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm);以水(磷酸調(diào) pH 至 3.0)為流動(dòng)相 A、乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫;流速0.5 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫方法見表1。

2.2 溶液制備

精密稱取華法林鈉對(duì)照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶劑A(水∶乙腈=2∶8)振搖溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(100 μg/mL)。取華法林鈉片20片，精密稱定總質(zhì)量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉(約相當(dāng)于華法林鈉5 mg)，置50 mL容量瓶中，加溶劑A適量，超聲10 min使溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液(100 μg/mL)。

表1 HPLC法與UPLC法梯度洗脫方法

2.3 UPLC方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取 2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液 3，4，5，6，8 μL，注入超高效液相色譜儀，按UPLC色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以樣品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=4.36×106X －1.53×104，r=0.999 8(n=5)。結(jié)果，華法林鈉進(jìn)樣量在0.284～0.758 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

最低檢測(cè)限確定:以信噪比為3∶1(S/N=3)的濃度進(jìn)樣，華法林鈉的最低檢測(cè)限為0.02 ng。

精密度試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果華法林鈉保留時(shí)間的 RSD為 0.06%，峰面積的 RSD為0.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一批(批號(hào)為1555638)樣品粉末6份，制備供試品溶液，按UPLC色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為0.28%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24 h按擬定色譜條件依法進(jìn)樣 6次。結(jié)果峰面積的RSD為0.21%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取半量已知含量的同一批(批號(hào)為1555638)樣品細(xì)粉9份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密加入0.51 g/L華法林鈉對(duì)照品溶液，稀釋至刻度，搖勻，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 華法林鈉加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):精密稱取4－羥基香豆素和(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮對(duì)照品各10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶劑A溶解，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，精密加入2.2項(xiàng)下供試品溶液5 mL，加溶劑A溶解，精密量取5 mL置500 mL容量瓶中，加溶劑A稀釋至刻度，即得供試品溶液。各組分的洗脫順序?yàn)?－羥基香豆素、(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮和華法林鈉，前兩者峰的分離度應(yīng)不小于2.5。結(jié)果及色譜圖見表3和圖1。

表3 HPLC法與UPLC法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

2.4 樣品含量測(cè)定

取5批樣品，按2.2項(xiàng)下方法分別制備對(duì)照品和供試品溶液，分別按2.1項(xiàng)下HPLC和UPLC色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果表明，在UPLC色譜條件下，華法林鈉峰形良好，與雜質(zhì)峰的分離度高，且UPLC和HPLC方法所得結(jié)果一致，見表4。HPLC法與UPLC法中華法林鈉對(duì)照品與供試品的典型色譜圖見圖2。

表4 UPLC法和HPLC法含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比(n=5)

圖2 典型色譜圖

3 討論

梯度洗脫方法優(yōu)化:原標(biāo)準(zhǔn)中HPLC法梯度洗脫時(shí)間為50min，流速為1.5 mL/min，時(shí)間長(zhǎng)，流速大，消耗大量有機(jī)溶劑。采用UPLC 法將洗脫時(shí)間縮短至 12.5 min，流速降至 0.5 mL/min，時(shí)間和流速均減少了70%以上，實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定含量，同時(shí)減少溶劑消耗量，極大地降低了成本，減少了環(huán)境污染。

流速選擇:本研究中嘗試了多種流速后發(fā)現(xiàn)，流速小時(shí)，華法林鈉出峰時(shí)間長(zhǎng)，使梯度洗脫時(shí)間過長(zhǎng)，達(dá)不到快速分離的目的;流速大時(shí)，系統(tǒng)和色譜柱反壓過大，無(wú)法正常分析樣品;最后確定流速為0.5 mL/min，在系統(tǒng)可承受壓力范圍內(nèi)和在保證分離效果的前提下，盡可能地縮短了梯度洗脫時(shí)間。

進(jìn)樣量選擇:試驗(yàn)確定了方法的線性范圍，并對(duì)系統(tǒng)精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，進(jìn)樣量小會(huì)降低方法的精密度和重復(fù)性，進(jìn)樣量大會(huì)超出線性范圍，出現(xiàn)過載現(xiàn)象。最終確定了進(jìn)樣為5 μL。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):由結(jié)果可見，2種方法均能良好地達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求，但UPLC法峰形更好，各組分間的分離度更優(yōu)。

本研究中建立的UPLC法相比HPLC法用于華法林鈉片的含量測(cè)定，具有檢測(cè)效率高、靈敏度好、準(zhǔn)確快速且綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，并可推廣用于華法林鈉其他制劑的含量測(cè)定。

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