紅花提取物對(duì)Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究＊

鄧桂球，張 蓓，孔秀娟 ，張榕文 ，勞梓釗，萬玉華，李 耿

(1.廣東省廣州市白云區(qū)第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510140;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405;3.霸王＜廣州＞有限公司)，廣東 廣州 510006)

類固醇5α-還原酶是雄激素代謝的關(guān)鍵酶，催化各種類固醇底物的△4，5雙鍵還原，使睪酮(T)轉(zhuǎn)化為生物活性更強(qiáng)的另一種雄激素——雙氫睪酮(DHT)[1]。5α-還原酶是定位于靶細(xì)胞微粒體上的膜蛋白，目前認(rèn)為其有3種同工酶[2]，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。5α-還原酶Ⅰ主要存在于肝臟及非生殖器官皮膚，發(fā)揮生理作用的最適pH為6～9;而5α-還原酶Ⅱ主要存在于前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊，作用最適pH為5.5[3]，5α-還原酶Ⅲ研究較少，其在難治愈的前列腺癌中過度表達(dá)[4]。多種疾病如前列腺增生[5]、雄激素脫發(fā)[6]、痤瘡[7]、多囊卵巢綜合征、男性假兩性體畸形、女性多毛癥[8]等均與局部雄激素代謝異?；蛐奂に刈饔糜嘘P(guān)，而5α-還原酶在其中有重要作用。目前市場上有許多合成的甾體和非甾體5α-還原酶抑制劑，但其往往有很多不良反應(yīng)，難以滿足廣大患者的需求。因此，從中藥中篩選出高效低毒的新型5α-還原酶抑制劑，將其運(yùn)用于前列腺增生、雄激素脫發(fā)、痤瘡等醫(yī)藥健康產(chǎn)品的研究，具有重要的研究價(jià)值和廣闊的市場前景。近年來，國內(nèi)外已有超過20種藥物被報(bào)道具有較強(qiáng)的5α-還原酶抑制活性。紅花有活血祛瘀功效，為中藥育發(fā)液中臣藥，有促進(jìn)毛發(fā)生長的作用[9]。為進(jìn)一步探討其治療雄激素脫發(fā)的機(jī)理，本試驗(yàn)中以5α-還原酶為研究靶點(diǎn)，考察紅花提取物對(duì)該酶的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

藥品與試劑:紅花(霸王＜廣州＞有限公司)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)賴小平教授鑒定為菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.的干燥花;非那雄胺(美國默沙東制藥有限公司);Easy-Lowyer蛋白測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)為2813B);睪酮(純度超過98%，BR，批號(hào)為#TCL201403);還原輔酶Ⅱ四鈉鹽/β-NADPH(純度 98%，Roche公司，批號(hào)為 10041939103);Tris-HCL(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)為SBJ0055);PMSF(純度超過99%，廣州齊云生物技術(shù)公司，批號(hào)為#KY201211);DTT(純度超過99%，廣州齊云生物技術(shù)公司，批號(hào)為#py200611);磷酸鹽緩沖液(PBS，上海立菲生物科技有限公司，批號(hào)為8113275);其他化學(xué)試劑都為國產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備:戴安高效液相色譜儀(UVD170U型檢測(cè)器，P680泵，ASI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-1005型柱溫箱);北京迪馬DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);TDL-5-A 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XXW-80A型旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);BS110S型萬分之一分析天平(香港佳立＜國際＞有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);RT-2100C型酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)。

動(dòng)物:雄性SD大鼠10只，SPF級(jí)，體重180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為20130020。

2 方法與結(jié)果

2.1 5α －還原酶的制備及定量[2，10]

制備:取雄性SD大鼠10只，禁食不禁水過夜后脫臼處死，迅速取肝臟及附睪(剝離脂肪組織)，稱重，于冰盤上剪碎，加入3倍量預(yù)冷的勻漿液(1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris-HCL 緩沖液;pH 分別為 5.5，5.5，6 ～9，6.8)在玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4℃及3 500 g離心2次，每次10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g離心50 min，取上清液即為粗微粒體酶，加一定量甘油，分裝，保存于-80℃超低溫冰箱中，臨用前取出。

定量:采用改良Lowry法定量測(cè)定蛋白含量，以酶提物中的總蛋白含量表示5α-還原酶的濃度，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=0.132 9 X+0.097 7，R2=0.993 2。經(jīng)計(jì)算肝臟中粗酶濃度為12.17 g/L(Ⅰ型酶)，附睪中粗酶濃度為5.77 g/L(Ⅱ型酶)。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -水(70∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長:242 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):精密吸取睪酮對(duì)照品溶液、空白溶液、空白溶液加對(duì)照品混合液，各取20 μL注入高效液相色譜儀。在上述色譜條件下，睪酮對(duì)照品峰峰形對(duì)稱，與其他組分分離度好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密稱取睪酮標(biāo)準(zhǔn)品36 mg，用甲醇配制成濃度為5 mmol/L的睪酮母液。將溶液逐級(jí)稀釋，質(zhì)量濃度依次為1.44，7.20，14.40，28.80，115.20，230.40，460.80 μg/mL。按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以睪酮峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A=0.263 C-0.410 6，R2=0.999 9。結(jié)果表明，睪酮質(zhì)量濃度在 1.44～460.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取睪酮標(biāo)準(zhǔn)品母液，加甲醇稀釋，得濃度為100 μmol/L的供試品溶液。按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為1.01%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取睪酮供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，2，6，12，24，48 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD 為 1.37%(n=6)，表明睪酮溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取睪酮供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD為2.11%(n=6)，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3 5α－還原酶抑制劑體外模型的建立

5α-還原酶活性測(cè)定方法[10-12]:設(shè)置不同反應(yīng)管和對(duì)照管，將Tris-HCL緩沖液、酶提取液、T、樣品(陽性對(duì)照及空白對(duì)照)、NADPH依次加入反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，37℃反應(yīng)30min，于0，30min時(shí)取樣0.5 mL，加甲醇1 mL中止反應(yīng)，渦旋1 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，HPLC法檢測(cè)。5α-還原酶活性以30 min內(nèi)每mg酶液轉(zhuǎn)化睪酮的量[T μmol/L(mg protein.30 min)]表示;T轉(zhuǎn)化率%=(T0濃度測(cè)定值-T30濃度測(cè)定值)/T0濃度測(cè)定值×100%;5α-還原酶活性抑制率%=(未加抑制劑的反應(yīng)體系T30轉(zhuǎn)化量-加抑制劑的反應(yīng)體系T30轉(zhuǎn)化量)/未加抑制劑的反應(yīng)體系T30轉(zhuǎn)化量×100%。

微量反應(yīng)體系的確立和反應(yīng)條件優(yōu)化:經(jīng)過反復(fù)摸索，建立總量為1 000 μL的反應(yīng)體系，見表1。為獲得最佳酶活性測(cè)定反應(yīng)參數(shù)，對(duì)底物T濃度、NADPH濃度、酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間條件進(jìn)行優(yōu)化。測(cè)得Ⅰ型酶的最佳反應(yīng)條件為底物T濃度1 000 μmol/L，NADPH 濃度 1 mmol/L，粗酶濃度 0.7 g/L，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間30 min;Ⅱ型酶為底物T濃度1 000 μmol/L，NADPH濃度1 mmol/L，粗酶濃度3 g/L，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間30 min。

表1 5α-還原酶反應(yīng)體系組成(μL)

非那雄胺對(duì)酶活性的影響:向反應(yīng)體系中加入特異性Ⅱ型5α - 還原酶抑制劑非那雄胺，濃度依次為 0.02，0.1，0.5，1 μmol/L，按擬訂方法進(jìn)行酶促反應(yīng)。求非那雄胺對(duì)酶活性的抑制率及IC50，評(píng)價(jià)該模型的可靠性。由圖2可見，非那雄胺可呈劑量依賴性抑制5α-還原酶活性，抑制率高達(dá)83.67%，其IC50為212 nmol/L，與國外文獻(xiàn)報(bào)道[13]的237 nmol/L接近。表明本試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定建立的5α-還原酶活性測(cè)定方法具有專一性，該模型可靠、穩(wěn)定，可用于5α-還原酶抑制劑的篩選。

圖2 非那雄胺濃度與抑制率關(guān)系

2.4 紅花水提物對(duì)Ⅰ型及Ⅱ型5α－還原酶活性的影響

紅花水提物樣品的制備:取紅花干燥藥材150 g，室溫下加入10倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取2次，每次0.5 h，8層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，將浸膏置于坩堝中，真空干燥箱中干燥，得紅花藥材粉末27.60 g，計(jì)算回收率。回收率(%)=干粉量/生藥材量×100%，得回收率為18.40%。試驗(yàn)前取紅花干燥粉末，用蒸餾水制成 50，10，2，0.4 g/L 的藥物溶液，受試藥物反應(yīng)質(zhì)量濃度分別為 2.5，0.5，0.1，0.02 g/L。

紅花水提物對(duì)Ⅰ型酶活性的影響:分別取不同質(zhì)量濃度的紅花樣品溶液，按擬訂方法進(jìn)行酶促反應(yīng)，求紅花水提物對(duì)Ⅰ型酶活性的抑制率，結(jié)果見表2。可見，與正常組比較，紅花提取物0.02 g/L劑量組酶活力、T轉(zhuǎn)化率均無顯著性差異(P＞0.05)，0.1，0.5，2.5 g/L 劑量組酶活力、T 轉(zhuǎn)化率均顯著性降低(P ＜0.05)。說明紅花提取物低劑量無顯著5α-還原酶活性，體外劑量大于0.1 g/L時(shí)可極顯著抑制Ⅰ型5α-還原酶活性，抑制率高達(dá)88.12%。

表2 紅花提取物對(duì)Ⅰ型酶活性的影響

紅花水提物對(duì)Ⅱ型酶活性的影響:分別取不同質(zhì)量濃度的紅花樣品溶液，按擬訂方法進(jìn)行酶促反應(yīng)，求紅花水提物對(duì)Ⅱ型酶活性的抑制率，結(jié)果見表3?？梢?，與正常組比較，紅花提取物0.1 g/L劑量組酶活力、T轉(zhuǎn)化率均無顯著性差異(P＞0.05);0.1，0.5，2.5 g/L 劑量組酶活力、T 轉(zhuǎn)化率均極顯著性降低(P ＜0.01)，說明紅花醇提物低劑量無顯著5α-還原酶活性，體外劑量大于0.1 g/L時(shí)可極顯著抑制Ⅱ型5α-還原酶活性，抑制率高達(dá)61.65%。

表3 紅花提取物對(duì)Ⅱ型酶活性的影響

3 討論

目前，5α-還原酶活性測(cè)定方法有紫外分光法、HPLC法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法、放射性同位素法、熒光法等。GC-MS法對(duì)試驗(yàn)儀器的要求較高;同位素法是國外最常用的甾體5α-還原酶的活性測(cè)定方法，其靈敏度高，同時(shí)可測(cè)定很多樣品，但具有放射性污染，同位素標(biāo)定和測(cè)定的誤差、層析板處理過程中的操作誤差等隨機(jī)測(cè)量誤差較多等缺點(diǎn);紫外法操作簡單，但由于所提取的酶為粗酶，純度不高，且測(cè)定的目標(biāo)物NADPH對(duì)5α-還原酶并無專一性，易受到其他酶的干擾而造成檢測(cè)偏差;ELISA法比定量T更能準(zhǔn)確反映5α-還原酶活性，但實(shí)際價(jià)格較貴。故本研究中選擇HPLC法，以5α-還原酶的底物T為檢測(cè)對(duì)象，排除了其他酶的干擾，且定量準(zhǔn)確，誤差較小。選用非那雄胺為陽性對(duì)照藥評(píng)價(jià)該模型的可靠性，結(jié)果顯示非那雄胺可呈劑量依賴性抑制5α-還原酶活性，抑制率高達(dá) 83.67%，其 IC50為212 nmol/L，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的237 nmol/L相近。說明本研究中建立的HPLC法5α-還原酶抑制劑篩選模型穩(wěn)定、可靠，可用于5α-還原酶抑制劑篩選。

彭永德等[14]指出，5α-還原酶Ⅱ?qū)︻惞檀嫉孜镉休^高的親和力(Km為nmol范圍)，而5α-還原酶Ⅰ的親和力較低(Km在μmol水平)。本研究結(jié)果顯示，5α-還原酶Ⅱ酶活力約 384.5 T μmol/L(mgprotein·30 min)，是5α-還原酶Ⅰ酶活力的10倍以上，其T轉(zhuǎn)化率約47.82%，而5α-還原酶Ⅰ為18.45%。在細(xì)胞漿內(nèi)，5α-還原酶可以將T轉(zhuǎn)化為生物活性更強(qiáng)的DHT，T和DHT與同一種雄激素受體(AR)結(jié)合，但DHT與AR的親和力是T的5倍以上。當(dāng)AR與DHT等雄激素結(jié)合后，AR的LBD構(gòu)象發(fā)生改變，與Hsp90等結(jié)合蛋白分離，AR形成活化的同源二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核中，識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子區(qū)的雄激素受體反應(yīng)元件(ARE)，誘發(fā)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，合成特異性的信使RNA及蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，促進(jìn)性器官的發(fā)育，促進(jìn)毛發(fā)、胡須等的生長等。因而轉(zhuǎn)化T活力更強(qiáng)的5α-還原酶Ⅱ多分布在睪丸、附睪等生殖器官及頭皮毛囊，主要對(duì)雄激素的合成代謝起作用;另一方面，T及其代謝產(chǎn)物DHT又均可刺激5α-還原酶Ⅱ基因的表達(dá)[15]，當(dāng)5α-還原酶Ⅱ過表達(dá)時(shí)，又導(dǎo)致局部的雄激素過多，從而引起前列腺增生[5]、雄激素脫發(fā)[6]等疾病。5α-還原酶Ⅰ多分布在肝臟和非生殖器官皮膚，主要對(duì)雄激素和其他類固醇激素的分解代謝起作用，5α-還原酶Ⅰ過多表達(dá)時(shí)常導(dǎo)致痤瘡[7]、女性多毛癥[8]等。

5α-還原酶是體內(nèi)參與雄激素代謝的一種重要的代謝酶，與全身多系統(tǒng)的疾病相關(guān)，抑制5α-還原酶的活性已成為一些疾病的治療靶點(diǎn)。雖然2種異構(gòu)酶表達(dá)具有相對(duì)的組織或細(xì)胞特異性，生理功能亦具有差異，如5α-還原酶Ⅱ主要分布在生殖系統(tǒng)、頭皮毛囊內(nèi)毛根鞘等部位，與生殖系統(tǒng)發(fā)育、毛發(fā)生長有關(guān)，5α-還原酶Ⅰ多分布在肝臟、皮膚細(xì)胞等，可能主要參與皮膚，尤其毛囊及皮脂腺成熟，對(duì)局部雄激素代謝、刺激皮脂過度分泌和痤瘡的發(fā)生中有一定的作用。但在正常的的前列腺組織、頭皮毛囊雖然5α-還原酶Ⅱ表達(dá)較多，也存在一定量的5α-還原酶Ⅰ表達(dá)。同時(shí)阻斷Ⅰ型、Ⅱ型同工酶降低血清及局部組織中DHT的程度遠(yuǎn)比單獨(dú)阻斷Ⅱ型酶強(qiáng)，因此同時(shí)阻斷Ⅰ型、Ⅱ型同工酶則是較好的選擇。目前已在臨床應(yīng)用的雙重5α-還原酶抑制劑度他雄胺在用于防治前列腺增生、雄激素脫發(fā)等取得了較好療效，但也存在不同程度的不良反應(yīng)，如性欲減退、勃起功能障礙等。本研究結(jié)果顯示，紅花提取物對(duì)5α-還原酶Ⅰ抑制率可達(dá)88.12%，對(duì)5α-還原酶Ⅱ抑制率可達(dá)61.65%，具有廣闊的開發(fā)前景，但其作用的有效部位還需進(jìn)一步研究。

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