細胞角蛋白19mRNA檢測在大腸癌患者外周血轉(zhuǎn)移檢測中的應用

李記彬　胡秀芬　劉放　宋純

[摘要]目的：研究細胞角蛋白19mRNA檢測在大腸癌（CRC）患者外周血轉(zhuǎn)移診斷中的應用價值。方法：選取我院2011年2月至2014年3月大腸癌患者共計126例進行RT-PCR檢測，另選40例大腸良性疾病患者與40例健康獻血者進行對照，采取熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應（FQ-RT-PCR）測定其CK19mRNA含量。并分析CK19mRNA在腫瘤回流血中的表達。結(jié)果：40例健康者1例CK19mRNA陽性表達，40例結(jié)腸良性疾病患者均為陰性；126例患者CKl9陽性例數(shù)74例，陽性表達率為58.73%，與健康組和良性組比較有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CK19陽性表達與性別、年齡、細胞分化類型無明顯相關（P>0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關性（P<0.05），同時Dukes分期C、D期患者陽性檢出率明顯高于A、B期患者（P<0.05）。結(jié)論：CKl9mRNA檢測應用于大腸癌患者外周血轉(zhuǎn)移診斷有較高的價值，可以為腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)診斷提供重要依據(jù)。

[關鍵詞]細胞角蛋白19；大腸癌；外周血轉(zhuǎn)移；應用

中圖分類號：R735.3 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2015）01-055-02

細胞角蛋白（CK）屬于多基因家族，包含有20多個不同亞類分子，主要表達集中在上皮細胞，同時可以不斷分泌進入到外周血中，因此可以將外周血特異性上皮性基因的異常表達作為檢測上皮性惡性腫瘤細胞的重要指標。CK20mRNA已成為膀胱癌、乳腺癌、大腸癌的血行轉(zhuǎn)移依據(jù)，本次研究主要圍繞大腸癌患者外周血轉(zhuǎn)移診斷中CK19mRNA的表達，分析其對大腸癌轉(zhuǎn)移診斷的臨床意義。

1.資料與方法

1.1一般資料

研究選取的126例大腸癌患者均為2011年2月至2014年3月在我院接受住院治療的病例，其中男性占84例，女性42例，年齡范圍32～84歲，平均年齡（57.9±3.2）歲，Dukes分期：A期30例、B期26例、C期48例、D期22例；細胞分化程度：高分化36例、中分化64例、低分化26例；組織學類型：結(jié)腸癌72例，直腸癌52例。同時選取40例健康獻血者（健康組）和40例結(jié)腸良性疾病患者（良性疾病組）進行對比。健康組：男性20例，女性20例，年齡范圍29-70歲，平均年齡（48.7±3.3）歲；良性疾病組：男性20例，女性20例，年齡范圍30-72歲，平均年齡（50.1±2.9）歲。三組患者性別、年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法

1.2.1RNA提取 分別抽取大腸癌患者、健康志愿者及結(jié)腸良性疾病患者外周靜脈血5mL，并采用枸櫞酸鈉抗凝，對單個核細胞采取淋巴細胞分離液進行分離，保存到離心管，持續(xù)5min離心每分鐘12000r，然后將Trizol lmL加入并使其均勻，后加200μL氯仿并混勻，離心15min，每分鐘12000r，吸取上清放置到離心管中加入500μL異丙醇混合均勻，離心10min，每分鐘12000r，然后使用75%乙醇進行1次漂洗，放置待干，添入DEPC水30μL，對RNA進行溶解，同時依靠紫外分光光度計對RNA的純度以及濃度進行測定。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA與PCR擴增 取總RNA于70℃變性5min后沐浴，根據(jù)每個反應將RT反應液18μL逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）1μL（5U/μL），RNA酶抑制劑（RNasin）1μL（40U/μL），將變性RNA5μL加入，水浴30min，溫度37℃，95℃變性5min。PCR擴增根據(jù)每個反應將43μL反應液加入，Taq酶2μL（5U/μL），RT反應產(chǎn)物5μL。反應條件：預變性為95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 20s，40個循環(huán)。72%延伸10min。同時以標準eDNA為陽性對照，無菌水為陰性對照。

1.3統(tǒng)計學方法

采用x2檢驗，P<0.05時有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1健康組、結(jié)腸良性組外周血CK19mRNA表達

40例健康者1例CK19mRNA陽性表達，40例結(jié)腸良性疾病患者均為陰性。

2.2大腸癌組外周血CK19mRNA表達

126例患者CK19陽性例數(shù)74例，陽性表達率為58.73%，與健康組和良性組比較有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3CK19 mRNA陽性表達與臨床病理參數(shù)的相關性

CRC中CK19 mRNA陽性表達與性別、年齡、細胞分化類型無明顯相關（P>0.05），陽性率與Dukes分期，分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P<0.05）見表1。

3.討論

大腸癌患者死亡的主要原因是大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和復發(fā)，而盡早對大腸癌轉(zhuǎn)移進行診斷是關鍵所在。CKl9在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，目前已成為研究熱點。腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落是血液循環(huán)開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的先兆，當腫瘤原發(fā)灶開始成熟后，腫瘤細胞才會開始轉(zhuǎn)移進入到外周血當中，人體免疫系統(tǒng)能夠清除大多數(shù)的細胞，但是仍會有少量殘留惡性腫瘤細胞集合成為癌細胞團，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶，循環(huán)血中的腫瘤細胞數(shù)量不多，因此需要高特異性和敏感度的檢測方式。PCR技術(shù)很好地解決了這一問題。RT-PCR可在106-107個正常細胞中檢測出癌細胞，目前在眾多腫瘤標志物的研究中均有廣泛的應用。FQ-RT-PCR是在RT-PCR基礎上發(fā)展而來的mRNA定量方法，具有靈敏度、特異性高、效率高、污染小等優(yōu)勢。

本研究應用PCR技術(shù)檢測外周血中CK19表達，結(jié)果健康體檢者中出現(xiàn)1例陽性表達者，原因有待進一步研究，良性組均無陽性表達。顯示126例外周血CK19mRNA陽性檢出率為58.73%。相關性分析可見Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與外周血中CK19表達率相關。C、D期的陽性檢出率明顯高于A、B期，提示C、D期大腸癌預后不良，并存在較高的轉(zhuǎn)移風險。

綜上所述，CK19 mRNA在CRC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。CK19mRNA檢測應用于CRC患者外周血轉(zhuǎn)移診斷有較高的價值，可以為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和復發(fā)提供重要診斷依據(jù)。