柿葉總黃酮的制備及對肝損傷的保護(hù)作用

呂 超

（西安財經(jīng)學(xué)院體育教學(xué)部，陜西西安710100）

柿葉總黃酮的制備及對肝損傷的保護(hù)作用

呂 超

（西安財經(jīng)學(xué)院體育教學(xué)部，陜西西安710100）

以75%乙醇為溶劑提取、聚酰胺型大孔樹脂柱初步純化，制得柿葉總黃酮；采用四氯化碳（CCl4）誘使昆明種小鼠急性肝損傷模型，研究柿葉總黃酮對肝臟的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，柿葉總黃酮能夠明顯減輕CCl4誘使的肝損傷，降低血清中ALT、AST活性和肝組織MDA含量，提高肝組織中SOD和CAT活性，且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果表明柿葉總黃酮對CCl4所致急性肝損傷具有強(qiáng)的保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與其對脂質(zhì)氧化的抑制作用及其抗氧化活性有關(guān)。

柿葉；總黃酮；肝保護(hù)作用；抗氧化活性

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的天然產(chǎn)物，由于其具有抑菌消炎、抗氧化［1－2］、預(yù)防心血管疾?。?］和抗腫瘤［4］等功效，近年來受到人們的極大關(guān)注。柿葉為柿樹科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f）的新鮮或干燥葉片，味苦、性寒、無毒，其主要有效成分是黃酮類化合物［5］。已有研究表明柿葉總黃酮具有多種藥理和臨床作用［3，6－8］，因而成為一類極具開發(fā)前景的天然植物藥用資源。

近年來，隨著環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，人類對各類化學(xué)藥物的使用大幅增加，與肝臟有關(guān)的疾病呈不斷上升趨勢。各種肝臟疾病，諸如A或B型肝炎、中毒性肝炎、肝囊腫、肝血管瘤、肝纖維化和肝硬化等已嚴(yán)重威脅人類健康，因而肝損傷保護(hù)研究成為天然藥物研究［9－14］的熱點(diǎn)之一。本研究以乙醇為溶劑提取，經(jīng)聚酰胺柱初步純化，制得柿葉總黃酮（PLTF），采用CCl4誘使小鼠急性肝損傷模型，研究柿葉總黃酮對化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用，以期為開發(fā)柿葉資源，進(jìn)一步研究和開發(fā)肝臟保護(hù)性藥物作一些探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠（25±2g）48只，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。分籠飼養(yǎng)，保持室溫24～26℃，相對濕度60%～65%，自由進(jìn)食和飲水。1.2 藥品、試劑及儀器

柿葉購自陜西西安藥材市場，清洗陰干后粉碎，用245μm粒徑過篩，備用。四氯化碳（AR），購自天津市化學(xué)試劑一廠，用植物油配成0.2%的溶液供實(shí)驗(yàn)使用；聯(lián)苯雙酯滴丸，購自浙江萬邦藥業(yè)有限公司（批號081010，規(guī)格1.5mg／丸），按常規(guī)方法配制成質(zhì)量濃度為10mg／mL聯(lián)苯雙酯水溶液供實(shí)驗(yàn)使用；丙二醛（MDA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒以及蛋白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；聚酰胺粉（1 165～490μm粒徑，上海潤捷化工公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

724微型可見分光光度計（上海光學(xué)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠）；JJ－2組織搗碎勻漿機(jī)（金壇市開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AnkeTGL－18C－C型離心機(jī)（德國BMGLABTECH公司）；快速恒溫數(shù)顯水箱（常州國華電器有限公司）。

1.3 柿葉黃酮的提取與初步純化

參照文獻(xiàn)［15］方法，稱取柿葉粉10g，置于平底燒瓶，加入石油醚浸泡脫脂和除去葉綠素，然后加入75%乙醇100mL，水浴加熱于70℃條件下提取90min，抽濾，定容；以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，AlCl3顯色法在433nm處測定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得提取液中總黃酮含量，計算提取率。然后將提取液上聚酰胺型大孔樹脂柱吸附，用蒸餾水淋洗至洗脫液無色后，用100mL濃度為70%的乙醇解吸，收集流出液，濃縮蒸干，105℃干燥，得初步純化的柿葉總黃酮（PLTF）。

1.4 動物的分組與處理

取昆明種小鼠48只，隨機(jī)分為6組：正常對照（NC）組、CCl4急性肝組織損傷模型（MC）組、柿葉總黃酮低、中、高（PLTF 1－3）組和陽性對照（PC）組，每組8只。NC和MC組每天用蒸餾水灌胃一次（10 mL／kg），PC組每天用聯(lián)苯雙酯水溶液灌胃一次（100mg／kg），PLTF 1－3組每天分別以50、100、300 mg／kg劑量灌胃一次。上述處理連續(xù)21d。第22天，除NC組用等劑量植物油灌胃外，其余各組用經(jīng)超聲波混勻的四氯化碳植物油溶液（0.2%）灌胃（10 mL／kg）。隨后禁食24h，稱重；從眼眶取血，脫臼致死，解剖取出肝臟。

1.5 血樣和組織樣品處理

“商”字的字形所描繪的，是殷人祭祀商星的形象，因?yàn)橐笕送ㄟ^觀測商星的運(yùn)行位置來判斷用火活動的時間是否適宜。正是由于商星在殷人生活中的這種重要作用，使得殷人主祀商星，并用之以名其部族，繼以名其國邑及朝代，而商星也在“分野”文化中，始終充當(dāng)著對應(yīng)殷人國土的星宿。

血樣在室溫下放置1h，37℃水浴5min，3 000 r／min離心10min，分離出血清，用于ALT和AST活性測定。

肝臟組織用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，用濾紙拭干，稱重。精密稱取一定量的肝組織，加入6倍肝重的冰冷生理鹽水，用組織勻漿機(jī)搗碎、勻漿，將組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，用3倍肝重的生理鹽水沖洗組織勻漿機(jī)中的殘留物。將已經(jīng)制成的10%的勻漿在4℃、4 000r／min條件下離心5min，吸取上清液即為待測的肝組織勻漿，根據(jù)測試需求稀釋到一定的濃度，用于測定肝臟組織CAT、SOD活性和MDA含量。

1.6 生化指標(biāo)測定

取一定量的血清樣，按試劑盒說明書操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血清中ALT和AST的活力單位。取適當(dāng)稀釋的肝組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明書操作測定，按公式計算肝組織勻漿中總蛋白和MDA含量以及SOD和CAT活性。

1.7 肝組織病理觀察

取肝左葉小塊（0.5cm×0.5cm×0.5cm），置4%甲醛緩沖溶液（pH 7.4）中脫水，按常規(guī)方法包埋、切片，以蘇木精－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理改變。

1.8 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，單因素方差檢驗(yàn)比較其差異性，P＜0.05為差異，P＜0.01為顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 柿葉總黃酮的提取與初步純化

植物中黃酮類化合物有多種提取方法，文獻(xiàn)［15］比較了熱水提取法、乙酸乙酯提取法、甲醇和乙醇提取法，認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇提取法對柿葉黃酮提取率較高，提取物容易濃縮和干燥，是一種較好的提取方法。本文亦采用75%乙醇為溶劑提取，柿葉粉碎后用245μm粒徑過篩，液固比由1∶5提高至1∶10，柿葉總黃酮的提取率明顯提高，達(dá)到13.8%。文獻(xiàn)［16］研究結(jié)果表明，聚酰胺型大孔樹脂對柿葉黃酮具有良好的吸附動力學(xué)特性，并有較好的解吸附率，較其他種類樹脂更適宜提純柿葉黃酮。本文采用聚酰胺樹脂柱對柿葉黃酮進(jìn)行初步純化，純化后柿葉提取物中總黃酮含量達(dá)72.5%。

2.2 柿葉黃酮對模型小鼠肝指數(shù)的影響

分別稱取禁食24h后急性肝組織損傷模型小鼠體重和肝臟重量，計算肝指數(shù)L：

L＝m1（肝的重量）／m2（小鼠體重）×100%，其結(jié)果列于表1。

肝指數(shù)能反應(yīng)動物的免疫功能和肝功能的狀況，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)炎腫大時肝的重量就會增加，肝指數(shù)就會明顯地變大。從表1可見，MC組小鼠的肝指數(shù)比NC組有顯著性（P＜0.01）增加，表明與正常組比較模型組小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重發(fā)炎，CCl4誘使小鼠急性肝損傷模型成功構(gòu)建；PC組小鼠的肝指數(shù)與MC組有顯著差異（P＜0.01），驗(yàn)證了聯(lián)苯雙酯具有防護(hù)急性四氯化碳肝損傷的作用；低劑量給藥（50 mg／kg）PLTF 1組小鼠的肝指數(shù)雖有改善，但并不明顯，隨著柿葉黃酮給藥濃度增加，肝指數(shù)逐漸恢復(fù)；當(dāng)給藥濃度達(dá)到300mg／kg（PLTF3）時，肝指數(shù)基本上恢復(fù)到正常水平（與NC組無顯著性差異）。據(jù)此，可以初步看出，柿葉總黃酮能恢復(fù)改善由CCl4引起的免疫抑制作用，提高免疫低下小鼠的特異性細(xì)胞免疫功能，起到對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

2.3 柿葉總黃酮對模型小鼠血清ALT和AST活性的影響

血清中ALT和AST活性測定結(jié)果亦列于表1。與NC組相比，MC組小鼠血清中ALT和AST活性顯著（P＜0.01）升高；PC組雖與MC組相比也有顯著性差異（P＜0.01），但與NC組相比亦有明顯差異（P＜0.05），仍未達(dá)到正常水平；柿葉總黃酮給藥組ALT和AST活性均有下降，且隨著給藥劑量增大，效果愈發(fā)明顯；PLTF2組與MC組相比，ALT和AST活性水平已有明顯差異（P＜0.05），而與PC組無明顯差異；PLTF3組ALT和AST水平已經(jīng)基本達(dá)到正常，且ALT活性明顯低于PC組水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，柿葉總黃酮能夠使CCl4誘使急性肝損傷小鼠的血清ALT和AST水平升高得到有效抑制，其作用超過聯(lián)苯雙酯。

表1 柿葉總黃酮對CCl4誘使急性肝損傷小鼠肝指數(shù)、血清ALT和AST水平的影響Tab.1 Effect of PLTF on liver index，ALT and AST levels in serum of CCl4－treated rats（n＝8）

2.4 柿葉總黃酮對模型小鼠肝組織MDA含量和SOD、CAT活性的影響

模型小鼠肝組織MDA含量和SOD、CAT活性測定結(jié)果列于表2。從表2可見，MC組與NC組相比，肝組織MDA含量有顯著升高（P＜0.01），說明小鼠肝臟由于脂質(zhì)過氧化而造成了損傷；PC組與MC組相比MDA含量顯著降低（P＜0.01），但與NC組相比MDA含量仍稍高；柿葉總黃酮給藥組MDA含量均有下降，且明顯地呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；PLTF2組與MC組相比，MDA含量已有明顯差異（P＜0.05），已接近PC組水平；當(dāng)給藥濃度達(dá)到300mg／kg（PLTF3）時，MDA含量已經(jīng)下降至正常水平。研究結(jié)果表明，柿葉總黃酮能降低CCl4誘導(dǎo)引發(fā)的小鼠肝組織中脂質(zhì)過氧化物MDA含量，即能減輕或消除CCl4對肝細(xì)胞的損傷。

表2 柿葉總黃酮對CCl4誘使肝損傷小鼠肝組織MDA含量和SOD、CAT活性的影響Tab.2 Effect of PLTF on MDA，SOD and CAT of CCl4－treated rats（n＝8）

CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷，使MC組肝組織中SOD和CAT活性顯著地低于NC組和PC組（P＜0.01）；三個劑量的給藥組（PLTF1－3）肝組織中SOD和CAT活性均有程度不同的增加，且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；PLTF2雖未達(dá)到NC組和PC組水平，但與MC組相比，已有明顯差異（P＜0.05）；PLTF3已達(dá)到或接近NC組水平，且SOD和CAT活性均高于PC組水平（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，柿葉黃酮可以抑制CCl4所致肝臟SOD和CAT活性下降。

2.5 柿葉總黃酮對模型小鼠肝組織病理變化的影響

2.5.1 肉眼觀察 仔細(xì)觀察小鼠肝臟，正常對照組肝臟表面光滑、柔軟，色澤稍暗；模型組肝臟腫大、表面粗糙、較脆，顏色灰暗；柿葉總黃酮給藥組與模型組比較，表面光滑度和色澤均有不同程度改善，高劑量組外觀和正常對照組小鼠肝臟已無明顯差異。

2.5.2 光學(xué)顯微鏡觀察 正常對照組（圖1A）肝小葉呈多面體形，肝索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核大居中，胞質(zhì)豐富，未見壞死細(xì)胞和炎癥細(xì)胞；而模型組（圖1B）肝細(xì)胞碎屑樣壞死，點(diǎn)狀壞死及肝細(xì)胞濁腫水樣變性，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重；柿葉總黃酮給藥組上述癥狀明顯減輕，低劑量組（圖1D）效果稍差，中劑量組（圖1E）、高劑量組（圖1F），炎癥細(xì)胞明顯減少，正常肝細(xì)胞數(shù)目增多，與聯(lián)苯雙酯給藥組（圖1C）沒有明顯差別。

圖1 CCl4誘使急性肝損傷小鼠肝組織學(xué)變化Fig.1 Histological results of liver tissues stained with HE under light microscope in CCl4－treated mice

3 討論

四氯化碳（CCl4）肝損傷模型是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動物模型，CCl4引起肝損傷的機(jī)制系CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P－450酶激活下產(chǎn)生活性三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由基，這些自由基可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價結(jié)合［9］，也可攻擊肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死［1011］。由于肝臟內(nèi)源物可通過受損細(xì)胞膜滲漏進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，臨床上一般認(rèn)為肝臟受損傷的結(jié)果和標(biāo)志是血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶等肝臟胞內(nèi)酶活性上升［12］。研究結(jié)果顯示，柿葉總黃酮能有效地抑制四氯化碳所致小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性上升，這可能與柿葉黃酮能有效地清除一些損害細(xì)胞的自由基有關(guān)。

肝臟中MDA含量及SOD、CAT活性高低可以反映肝臟受自由基和脂質(zhì)過氧化損傷的程度。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低反映了膜脂質(zhì)過氧化程度的強(qiáng)弱和細(xì)胞損傷的程度［10，12］；SOD是體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，可以抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［10，13］；CAT參與生命過程中的各種代謝反應(yīng)，是肝臟組織細(xì)胞內(nèi)最重要的能清除代謝過程中各種自由基的抗氧化物質(zhì)之一［14］。研究結(jié)果顯示，柿葉總黃酮能明顯降低CCl4致肝損傷肝組織中MDA的含量，顯著提高SOD和CAT活性。

張艷和楊建雄［17］已經(jīng)報道了柿葉醇提物乙酸乙酯萃取制劑對四氯化碳急性肝損傷的保護(hù)作用，但認(rèn)為以100mg／kg劑量較好，200mg／kg劑量對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用減弱。而本研究結(jié)果表明，隨著柿葉總黃酮給藥劑量增大，肝損傷的保護(hù)效果愈發(fā)明顯。這可能與給藥的純度有關(guān)，較高劑量的酚酸類物質(zhì)對肝細(xì)胞有一定損害作用［17］。在文獻(xiàn)［17］的報道中，效果最好的100mg／kg劑量，其所有測定的生化指標(biāo)均遠(yuǎn)未達(dá)到正常水平；本研究結(jié)果則存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)給藥劑量達(dá)到300mg／kg時，所有生化指標(biāo)均與正常組無顯著性差異。顯然，300mg／kg應(yīng)為給藥的最高劑量。

4 結(jié)論

柿葉總黃酮能夠拮抗CCl4誘發(fā)的肝細(xì)胞自由基和脂質(zhì)過氧化損傷，對四氯化碳誘使的小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，其作用力與聯(lián)苯雙酯接近。因此，柿葉總黃酮具有很好的開發(fā)利用價值和臨床應(yīng)用前景。本文研究為進(jìn)一步研究和開發(fā)柿葉總黃酮藥物提供了參考依據(jù)。

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〔責(zé)任編輯 王 勇〕

Study on the protective effect of total flavonoids in persimmon leaves against carbon tetrachloride－induced acute liver injury

LüChao
（Department of Physical Education，Xi′an University of Finance and Economics，Xi′an 710100，Shaanxi，China）

The flavonoids were extracted from dried persimmon（Diospyros kaki L.f）leaves with 75%ethanol and preliminarily purified with macroporous resin.The protective effect of persimmon leaves total flavonoids（PLTF）against carbon tetrachloride－induced（CCl4）on acute liver injury in rats of was investigated.The results showed that PLTF obviously reduced the liver damage，significantly decreased the AST and ALT levels in serum，remarkably lowered the liver indexes and MDA level，and elevated the SOD and CAT levels in hepatic tissues.These results indicate that PLTF has a protective effect against CCl4－induced acute hepatotoxicity in rats，and the hepatoprotective effects may be due to both the inhibition of lipid peroxidation and the increase of antioxidant activity.

persimmon leaves；total flavonoids；hepatoprotective effect；antioxidant activity

R284.2

：A

1672－4291（2015）05－0067－04

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.05.354

2015－03－06

國家自然科學(xué)基金（20875060）

呂超，男，講師，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院訪問學(xué)者，研究方向?yàn)檫\(yùn)動生物化學(xué)與運(yùn)動營養(yǎng)學(xué)。E－mail：Jardon－800＠163.com