大鼠雪旺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)純化及鑒定

張春燕，張自強(qiáng)，劉玉梅，鄧 雯，王玉琴,2

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003;2.河南省肉羊繁育工程技術(shù)中心，河南 洛陽 471003)

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大鼠雪旺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)純化及鑒定

張春燕1，張自強(qiáng)1，劉玉梅1，鄧 雯1，王玉琴1,2

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003;2.河南省肉羊繁育工程技術(shù)中心，河南 洛陽 471003)

雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程中起著關(guān)鍵的作用，因此，建立一種穩(wěn)定的分離、培養(yǎng)和純化方法極其重要。本文通過一種簡單的培養(yǎng)方法獲取大量高純度的雪旺細(xì)胞。首先，從出生6 d的SD大鼠分離獲得坐骨神經(jīng)，用胰酶和膠原酶消化得到雪旺細(xì)胞；待細(xì)胞貼壁后，用阿糖胞苷進(jìn)行純化，隨后在培養(yǎng)基中加入氟絲扣林促進(jìn)細(xì)胞增殖研究。研究結(jié)果顯示：雪旺細(xì)胞的形態(tài)以細(xì)長梭形為主，少數(shù)呈現(xiàn)三角形。混雜的成纖維細(xì)胞經(jīng)阿糖胞苷作用后逐漸變圓、死亡，而雪旺細(xì)胞無明顯減少，純化后的雪旺細(xì)胞經(jīng)氟絲扣林作用后增殖速度提高。經(jīng)S-100和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光鑒定，雪旺細(xì)胞的純度達(dá)到97%以上，因此，通過該方法可獲得大量高純度的雪旺細(xì)胞。

雪旺細(xì)胞；體外培養(yǎng)；純化；鑒定

0 引言

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能夠營養(yǎng)保護(hù)外周神經(jīng)，在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[1]，它可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)軸突再生，保護(hù)外周神經(jīng)的正常功能[2]。但在雪旺細(xì)胞的提取過程中總會混雜有成纖維細(xì)胞，因此，要獲得高純度的雪旺細(xì)胞，就必須除去其中混雜的成纖維細(xì)胞[3]，傳統(tǒng)的除去成纖維細(xì)胞的方法有很多，但是效果都不太理想。因此，本研究通過對傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，采用雙酶消化法和阿糖胞苷對分離培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞進(jìn)行兩次純化，并添加氟絲扣林促進(jìn)細(xì)胞增殖，以此獲得大量高純度的雪旺細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

出生6 d的雄性SD仔鼠5只，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：生產(chǎn)許可證SCXK(豫)2010-0002。

1.2 主要試劑

高糖培養(yǎng)基(DMEM)：GIBCO公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液：碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料公司；S-100：Abcam公司；膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)：Chemicon公司；阿糖胞苷、氟絲扣林、Ⅰ型膠原酶：SIGMA公司。

1.3 儀器設(shè)備

倒置熒光顯微鏡：Olympus公司；CO2培養(yǎng)箱：Thermo公司；超凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 雪旺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與純化

選擇出生6 d的SD仔鼠，頸椎脫臼處死后在無菌環(huán)境中取出兩側(cè)坐骨神經(jīng)，剪成2 mm的小段；然后用含有青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，將神經(jīng)組織轉(zhuǎn)移到離心管中，并向其中加入2 mL(2.5 g/L)的胰蛋白酶和1 mL(625 U/mL)Ⅰ 型膠原酶，37 ℃下在恒溫振蕩器中消化30 min。然后，加入血清終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，剩余組織中加入625 U/mL的 Ⅰ 型膠原酶2 mL，于37 ℃下消化50～60 min。隨后加入等體積的DMEM培養(yǎng)液稀釋，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，最后用DMEM培養(yǎng)液(每100 mL DMEM培養(yǎng)液中含15 mL FBS)重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞基本貼壁后，向培養(yǎng)瓶中加入含10-5mol/L阿糖胞苷的DMEM培養(yǎng)液4 mL作用48 h，然后改為含2 μmol/L 氟絲扣林的DMEM培養(yǎng)液，每2～3 d換一次液，當(dāng)細(xì)胞長至80%融合時開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.4.2 雪旺細(xì)胞的鑒定

純化后的雪旺細(xì)胞培養(yǎng)到第3代，將細(xì)胞消化離心并制作爬片，72 h后各組細(xì)胞爬片用0.01 mol/L PBS清洗2次，然后放到40 g/L的多聚甲醛固定1 h，在室溫下加入100 mL/L甲醇和30 g/L過氧化氫封閉40 min，再加PBS 清洗3次。隨后加入2 mL、2.5 g/L的胰蛋白酶，在室溫下放置5 min后用PBS振蕩洗滌3次，再用正常的羊血清37 ℃孵育1 h后吸出，用S-100(鼠抗IgG，抗體和PBS按1∶500體積稀釋)、GFAP抗體(鼠抗IgG，抗體和PBS按1∶500體積稀釋)4 ℃孵育過夜后，用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(抗體和PBS按1∶250體積稀釋)37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次，晾干后封片于倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代和傳代細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞接種3 h后少量細(xì)胞開始貼壁，24 h后貼壁細(xì)胞逐漸增加。貼壁細(xì)胞根據(jù)形態(tài)可分兩種：胞體寬大、體積較大、立體感不強(qiáng)的是成纖維細(xì)胞，此類細(xì)胞數(shù)量較少；兩極長突起、胞體呈細(xì)長梭形、邊緣有光暈的為雪旺細(xì)胞，此類細(xì)胞數(shù)量較多(見圖1)。隨著培養(yǎng)時間的延長，雪旺細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，阿糖胞苷處理后，雪旺細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，而成纖維細(xì)胞逐漸變圓，死亡(見圖2)。圖3為不同顯微倍數(shù)下氟絲扣林作用后的雪旺細(xì)胞。由圖3可見：純化后的雪旺細(xì)胞經(jīng)氟絲扣林作用后增殖速度明顯加快，在1周內(nèi)即出現(xiàn)增殖匯合。

圖1 接種24h后雪旺細(xì)胞的形態(tài)圖2 阿糖胞苷作用后的雪旺細(xì)胞

圖3 氟絲扣林作用后的雪旺細(xì)胞形態(tài)

2.2 雪旺細(xì)胞特異性蛋白S-100及GFAP的表達(dá)

經(jīng)免疫熒光檢測所培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP和S-100發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，圖4為S-100和GFAP經(jīng)免疫熒光染色后的表達(dá)結(jié)果。說明GFAP和S-100在細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，證實本試驗分離培養(yǎng)純化后的細(xì)胞為雪旺細(xì)胞。

(a) S-100 (b) GFAP

圖4 雪旺細(xì)胞特異性蛋白S-100及GFAP的表達(dá)

3 討論

由于雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)組成中具有重要的特殊地位和作用，因此成為近年來神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的熱點。到目前為止，周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)最好的方法是自體神經(jīng)移植[4]，而這種方法會導(dǎo)致供體神經(jīng)損傷。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)將體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞移植到神經(jīng)支架上，再植入動物體后對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)有一定的效果[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：人工神經(jīng)中雪旺細(xì)胞與嗅球成鞘細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用，在缺損神經(jīng)的再生速度上能起到與自體神經(jīng)移植同樣的效果[6]。人工神經(jīng)的發(fā)展應(yīng)用不僅能取得同自體神經(jīng)移植相似的治療效果，也避免了由于自體神經(jīng)取材而造成對供體的損傷。然而，人工神經(jīng)需要大量高純度的雪旺細(xì)胞，如何快速有效地獲取足夠的雪旺細(xì)胞仍是一個難點。1906年，Harrison發(fā)表了一篇關(guān)于雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的文章，自此之后，雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)便不斷得以改善。目前，雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有組織塊培養(yǎng)法、酶消化法以及兩者聯(lián)合應(yīng)用[7]，但這些方法都存在一定的缺陷，本研究通過試驗，摸索出最佳的雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。

文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)：雪旺細(xì)胞培養(yǎng)難度隨動物年齡增高而增大，因此，本試驗選擇出生6 d的SD大鼠，既避免了新生動物的坐骨神經(jīng)與周圍黏連過緊難于分離，也不會降低細(xì)胞的增殖速度。目前，雪旺細(xì)胞純化的方法主要有雙酶消化法、層黏連蛋白吸附法、免疫磁珠法及抗有絲分裂法等[9]，本研究在雙酶消化法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良。傳統(tǒng)的雙酶消化法是在剪碎的神經(jīng)組織塊中直接加入膠原酶和胰酶進(jìn)行長時間的消化[10]，這種消化方法不能徹底去除其中混雜的成纖維細(xì)胞。而本試驗在處理過的神經(jīng)中先加入胰酶和膠原酶，消化掉外層的成纖維細(xì)胞和部分細(xì)胞間質(zhì)，再通過較長時間的膠原酶消化去除剩余的細(xì)胞間質(zhì)，最終得到較為純凈的雪旺細(xì)胞。這種方法雖然多一個步驟，但能較好地去除雜質(zhì)，且不會對雪旺細(xì)胞造成顯著的損害。在雪旺細(xì)胞貼壁后，為了清除殘余的成纖維細(xì)胞，又在培養(yǎng)基中加入阿糖胞苷，進(jìn)一步進(jìn)行純化。在這一系列的純化過程中，為使雪旺細(xì)胞的數(shù)量提高，又加入了氟絲扣林促進(jìn)其增殖。研究發(fā)現(xiàn)氟絲扣林可以通透細(xì)胞、激活腺苷酸環(huán)化酶、提高胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的水平。環(huán)磷酸腺苷參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)中一些神經(jīng)細(xì)胞的分化及突起的生長，從而促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂[11]。本文的方法不僅可以較好地去除雜質(zhì)，對雪旺細(xì)胞影響較小，而且還大大提高了雪旺細(xì)胞的數(shù)量，取材方便，步驟簡單易掌握。

雪旺細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的重要來源一直備受關(guān)注，本試驗采用簡單的方法即可獲得大量高純度的雪旺細(xì)胞，為進(jìn)一步研究建立周圍神經(jīng)損傷模型提供了一個簡單可行的方案。

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國家自然科學(xué)基金項目(31101779)

張春燕(1990-),女,河南義馬人,碩士生;鄧 雯(1964-),男,河南商丘人，教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事動物生理學(xué)的教學(xué)和科研工作；張自強(qiáng)(1978-),男,通信作者,內(nèi)蒙古正藍(lán)旗人,副教授，博士,主要從事干細(xì)胞和神經(jīng)生物學(xué)方面的研究.

2015-01-06

1672-6871(2015)04-0082-03

Q813.11

A