PPAR-γ受體激活對百草枯中毒致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

劉振寧，郭治華，姚 民，趙 敏

·論著·

PPAR-γ受體激活對百草枯中毒致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

劉振寧，郭治華，姚 民，趙 敏*

目的 研究PPAR-γ受體激活對百草枯中毒致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法 48只SD雄性大鼠隨機(jī)平均分成3組，A組(百草枯中毒組)：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；B組(低劑量PPAR-γ受體激動劑羅格列酮預(yù)處理組)：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射3 mg/kg 羅格列酮；C組(高劑量PPAR-γ受體激動劑羅格列酮預(yù)處理組)：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射10 mg/kg 羅格列酮；D組(對照組)：1 mL生理鹽水腹腔注射。在注射百草枯后24 h和72 h時，每組取出6只，收集血清和肺組織標(biāo)本。采用Elisa方法檢測血清中IL-1β和TNF-α含量測定，行組織切片HE染色進(jìn)行肺損傷評分，利用Western blot方法檢測肺組織中caspase-3和AP-1 蛋白表達(dá)水平，采用免疫組化方法檢測caspase-3蛋白在肺組織中的表達(dá)。結(jié)果 大鼠百草枯中毒后血清炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α含量明顯增加。肺濕重/干重比以及肺損傷評分明顯增加。羅格列酮預(yù)處理組可以減輕肺組織損傷程度，降低血清中IL-1β和TNF-α含量，減少肺組織中caspase-3和AP-1 蛋白的表達(dá)。結(jié)論 應(yīng)用PPAR-γ激動劑羅格列酮可以抑制百草枯中毒大鼠肺組織中caspase-3和AP-1 蛋白表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和凋亡，對百草枯中毒導(dǎo)致急性肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

百草枯；急性肺損傷；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3；激活蛋白-1

0 引言

百草枯(Paraquat,PQ)中毒是臨床急診最常見的中毒之一。由于目前臨床缺乏有效解毒劑以及有限的治療手段，導(dǎo)致該病死亡率超過50%[1]。百草枯主要蓄積于肺泡細(xì)胞及細(xì)支氣管細(xì)胞，激活炎性細(xì)胞，分泌炎性細(xì)胞因子，并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急性肺損傷，最終表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭[2]。

轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(Activating protein-1,AP-1)[3]和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)[4]與細(xì)胞增殖凋亡和免疫反應(yīng)等關(guān)系密切，參與許多炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展過程。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferator activated receptors,PPAR-γ)被激活以后，可以誘導(dǎo)其下游抗氧化酶表達(dá)，產(chǎn)生抗氧化作用[5]。此外，PPAR-γ受體激動劑還可以產(chǎn)生強(qiáng)大抗炎作用[6]。本研究采用PPAR-γ受體激動劑羅格列酮對大鼠進(jìn)行預(yù)處理，然后觀察百草枯中毒肺損傷改善情況，并進(jìn)一步研究分析PPAR-γ受體的激活對caspase-3和AP-1 蛋白調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 羅格列酮,百草枯(Sigma-Aldrich，美國)；caspase-3，c-Fos，c-Jun和β-actin抗體(Santa，美國)；TNF-α和IL-1β Elisa試劑盒(R&D,美國)；SABC免疫組化試劑盒 (武漢博士德生物有限公司,中國)；其余均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。石蠟切片機(jī)和包埋機(jī)(Leitz，德國)；電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀(BIO-RAD，美國)；顯微攝像系統(tǒng)(Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本)。

1.2 動物 清潔級雄性Sprague Dawley大鼠，體重200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2003-0009,實(shí)驗動物使用許可證號: SYXK(遼)2003-0013。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠飼養(yǎng)的溫度控制20～25 ℃、濕度控制40%～70%，晝夜節(jié)律控制12 h，自由進(jìn)食水。該實(shí)驗方案經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 動物分組 將48只大鼠隨機(jī)平均分成4組，每組12只，具體如下： A組(百草枯中毒組)：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；B組(低劑量PPAR-γ激動劑羅格列酮預(yù)處理組)：在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射3 mg/kg 羅格列酮；C組(高劑量PPAR-γ激動劑羅格列酮預(yù)處理組)：在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射10 mg/kg 羅格列酮；D組(對照組)：1 mL生理鹽水腹腔注射。

1.4 標(biāo)本的采集及保存 在百草枯腹腔注射后24、72 h時，每組取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，將大鼠仰臥于鼠臺上固定，常規(guī)消毒后，打開胸腔，使用5 mL注射器刺入右心室，緩慢取血，避免溶血。將血放入10 mL離心管中，3 000 r/min、4 ℃，離心10 min，取上清分裝至1.5 mL EP管中，每管放約0.5 mL，置-80 ℃冰箱保存。心臟采血后，剪掉左心耳，使用生理鹽水沖洗肺組織，待清亮液體流出后，完整取出兩側(cè)肺組織，觀察肺組織顏色，質(zhì)地，有無出血等病理變化。生理鹽水清洗后，將肺葉液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存用以備檢測。

1.5 血清IL-1β和TNF-α含量測定 將收集的大鼠血清在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清，使用ELISA方法嚴(yán)格按照說明書(R&D,美國)檢測血清中IL-1β (31.25～2 000 μg/L)和TNF-α (12.5～800 μg/L)含量。

1.6 肺組織損傷評分 將固定好的大鼠肺組織切割組織塊，至厚度約0.5 cm左右，常規(guī)組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片，行HE 染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并按Mikawa等[7]方法進(jìn)行肺損傷評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：對①肺泡充血、②出血、③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集、④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四項指標(biāo)，分別依病變輕重評0～4分(0：無病變或非常輕微,1:輕度病變,2:中度病變,3:重度病變,4:極重度病變)。各項評定分?jǐn)?shù)相加為肺損傷總評分。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 將肺組織切片用0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)漂洗2次，3%H2O2孵育15 min，PBS洗3次，3% Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)15 min，滴加10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，室溫20 min，以減少非特異性染色，傾去切片上血清，滴加1∶500稀釋的兔抗鼠caspase-3抗體，4 ℃冰箱過夜。陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃過夜。PBS洗3次，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(1∶200)，室溫孵育20 min，PBS洗3次,滴加SABC,室溫20 min。PBS沖洗5 min×4次。DAB顯色劑顯色3 min左右，自來水充分沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染30 s，分色，二甲苯透明，晾干。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8 Western blot 法檢測肺組織caspase-3和AP-1的表達(dá) 按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明，提取肺上皮細(xì)胞核蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL 加樣；使用10% 聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V 條件下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加caspase-3一抗(1∶50)和c-Fos、c-Jun一抗(1∶100)，4 ℃過夜;用含0.1% Tween 20 的TBS 沖洗5 min × 3次，再加入二抗(1∶500)室溫下孵育2 h，用0.1%TBST 沖洗15 min × 3 次，ECL 發(fā)光檢測，X 線片顯影，掃描圖像，測得各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)后，比較其表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清IL-1β和TNF-α含量測定 在百草枯中毒24 h和72 h時，大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量較正常對照組明顯增加。經(jīng)過羅格列酮預(yù)處理以后大鼠血清中二者均有下降趨勢，高劑量組則較為明顯，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖1-A、B所示。

圖1-A 不同組別大鼠在24 h和72 h時血清IL-1β含量

圖1-B 不同組別大鼠在24 h和72 h時血清TNF-α含量

2.2 大鼠肺組織損傷評分 大鼠正常肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰，而百草枯中毒72 h時肺組織光鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血，肺間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤。使用高劑量羅格列酮預(yù)處理以后，中毒大鼠肺損傷程度明顯減輕，計算肺損傷評分明顯下降，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)。如圖2所示。

圖2 不同組別大鼠肺組織損傷評分

2.3 caspase-3蛋白在大鼠肺組織中的表達(dá) caspase-3蛋白在正常大鼠肺組織中支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞存在極少量表達(dá)。百草枯中毒以后其表達(dá)量明顯增加，當(dāng)使用羅格列酮激活PPAR-γ以后，其表達(dá)量則明顯減少，如圖3所示。

2.4 caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺組織中的量化分析 Western blot 結(jié)果提示，caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在百草枯中毒組中表達(dá)較正常組明顯增加。當(dāng)使用PPAR-γ激動劑羅格列酮預(yù)處理以后二者表達(dá)明顯下調(diào)，與百草枯中毒組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如圖4所示。

圖3 caspase-3蛋白在不同組別大鼠肺組織中的表達(dá)(IHC,×200)

3 討論

百草枯進(jìn)入機(jī)體以后很快被吸收入血，在肺組織聚集，造成肺損傷，然后通過腎臟進(jìn)行代謝。目前對于百草枯導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制不是非常明確，除了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)之外，炎癥反應(yīng)和凋亡均參與了百草枯誘導(dǎo)的肺損傷。病理學(xué)表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞，大量粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，釋放大量炎性細(xì)胞因子和趨化因子參與炎癥反應(yīng)。TNF-α和IL-1β是導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷的主要細(xì)胞因子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到極其重要的生物學(xué)作用。其分泌和表達(dá)除了可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化成熟，還可以行程復(fù)雜細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，形成復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)引起肺損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒患者血清中細(xì)胞因子如IGF-1、TNF-α和IL-10等均明顯高于正常人群[8]。與臨床發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似，本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒大鼠，血清中的炎性細(xì)胞因子如(IL-1β和TNF-α)均有明顯增加。

圖4 不同組別大鼠肺組織caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子AP-1是由 c-fos 和 c-jun 蛋白組成的同源或異源二聚體，參與調(diào)控很多炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[9]。在外界條件作用，c-jun和c-fos 表達(dá)水平增高，并轉(zhuǎn)變?yōu)閏-fos、c-jun 異源二聚體并引起下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄合成。研究發(fā)現(xiàn)，提取慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者外周血單核細(xì)胞，c-Fos和c-Jun表達(dá)水平明顯升高，可能與COPD炎癥過程中炎性細(xì)胞因子高表達(dá)有關(guān)[10]。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶。國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),大鼠百草枯中毒以后，隨著時間的推移肺組織凋亡細(xì)胞比例逐漸增多，caspase-3和caspase-8表達(dá)明顯增多，分析原因可能與百草枯導(dǎo)致線粒體功能障礙，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[11]。本實(shí)驗研究提示百草枯中毒大鼠肺組織中AP-1 和caspase-3表達(dá)明顯高于正常。說明百草枯導(dǎo)致AP-1的激活，引起包括IL-1β和TNF-α在內(nèi)多種細(xì)胞因子的激活；caspase-3的激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。炎癥反應(yīng)和凋亡效應(yīng)兩者相互影響相互作用，進(jìn)一步擴(kuò)大了百草枯對細(xì)胞的損傷和毒性效應(yīng)。

PPAR-γ在炎癥控制和免疫調(diào)節(jié)發(fā)面發(fā)揮重要的作用[12]。PPAR-γ直接與NF-κB和AP-1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制性復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子活化從而使下游細(xì)胞因子表達(dá)減少[13]；此外，PPAR-γ活化可以抑制中性粒細(xì)胞浸潤[14]，減少炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的分泌，進(jìn)而抑制單核細(xì)胞在肺組織中的趨化聚集[15]。動物實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑羅格列酮可能通過上調(diào) Bcl-2 表達(dá),下調(diào) Bax 和 caspase-3 表達(dá),抑制肝臟細(xì)胞凋亡，從而對肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[16]。本實(shí)驗也證實(shí)在百草枯致大鼠肺損傷的過程中，使用高親和力配體羅格列酮激活PPAR-γ受體以后，可以抑制AP-1和caspase-3的活化，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減少細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PPAR-γ的激活對百草枯中毒致肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，分析原因可能與抑制AP-1和caspase-3的活化有關(guān)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)和凋亡，具體分子機(jī)制還須要進(jìn)一步研究。

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Protective effect of PPAR-γ receptor activation on acute lung injury induced by paraquat poisoning in rats

LIU Zhen-ning,GUO Zhi-hua,YAO Min,ZHAO Min*

(Department of Emergency Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To study the protective effect of PPAR-γ receptor activation on acute lung injury induced by paraquat poisoning in rats.Methods 48 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups.Group A (paraquat poisoning),paraquat was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg/kg;Group B (low dose PPAR-γ agonist rosiglitazone pretreatment),rosiglitazone (3 mg/kg,ip)was administered 1 h before PQ exposure pretreatment group;Group C (high dose PPAR-γ agonist rosiglitazone pretreatment),rosiglitazone (10 mg/kg,ip)was administered 1 h before PQ exposure pretreatment group；Group D (control),1 mL normal saline was administered intraperitoneally.The concentration of TNF-α and IL-1β in venous blood was measured via Elisa at 24 h and 72 h after PQ exposure.The lung injury scores and caspase-3 positive signal were detected and analyzed at 72 h after PQ exposure via HE staining and immunohistochemistry respectively.Caspase-3 and AP-1 protein expression were also determined by using Western blot.Results The levels of IL-1β and TNF-α in the peripheral blood of PQ-treated rats were significantly increased compared with control group.Caspase-3 positive signal were detected in the lung tissues of PQ-treated rats.PPAR-γ receptor activation could attenuate lung tissue damage;decrease the caspase-3 and AP-1 protein expression compared with the PQ group.Conclusion PPAR-γ receptor activation can inhibit caspase-3 and AP-1 protein expression in lung tissue,attenuate inflammation and apoptosis,and exert a protective effect against paraquat-induced acute lung injury.

Paraquat;Acute lung injury;Caspase-3;AP-1

2014-11-12

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004

國家自然科學(xué)基金資助項目(81171793/H1503);衛(wèi)生部國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項目(2012-649)；遼寧省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究一般項目(L2014300)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503001

*通信作者