溫經(jīng)通絡(luò)散對奧沙利鉑所致周圍神經(jīng)毒性大鼠作用機制研究

王媛媛等

摘要：目的 探討溫經(jīng)通絡(luò)散外用對奧沙利鉑所致周圍神經(jīng)毒性大鼠的治療作用及機制。方法 采用腹腔注射奧沙利鉑4 mg/kg建立標準奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性大鼠模型。將雌性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組，中藥組予溫經(jīng)通絡(luò)散浸泡大鼠四肢及尾部，模型組大鼠予去離子水浸泡作為對照，正常組大鼠腹腔注射等體積5%葡萄糖。檢測溫度和機械刺激下大鼠痛覺超敏和過敏反應(yīng)，采用免疫組化方法檢測大鼠L4～L6段脊髓背角GFAP表達，RT-PCR檢測大鼠L4～L6段背根神經(jīng)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（GLT-1）mRNA表達。結(jié)果 模型組大鼠較正常組出現(xiàn)明顯行為學(xué)改變（P<0.05），中藥組大鼠較模型組行為學(xué)明顯改善（P<0.01）；模型組大鼠GFAP陽性細胞數(shù)較正常組明顯升高（P<0.05），中藥組升高不明顯；與正常組比較，模型組可見脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細胞胞體增大，突起增多、變粗及GLT-1 mRNA表達下降（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥組活性細胞減少、突起減少及GLT-1 mRNA表達水平升高（P<0.01）。結(jié)論 溫經(jīng)通絡(luò)散外用可顯著改善奧沙利鉑所致的神經(jīng)病理性疼痛。其作用機制可能與抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細胞活化進而介導(dǎo)的傷害性信號傳遞有關(guān)。

關(guān)鍵詞：溫經(jīng)通絡(luò)散；奧沙利鉑；周圍神經(jīng)毒性；神經(jīng)病理性疼痛；中醫(yī)外治；行為學(xué)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0070-04

Effects of Wenjing Tongluo Formula on GFAP Level in Perpheral Neuropathy Rats WANG Yuan-yuan1， JIA Li-qun2， DENG Bo2， ZHANG Hong-lei2， SONG Ai-ping2， DA Ji-ping2， YU Li-li2 （1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；2.China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China）

Abstract：Objective To discuss the treatment action and mechanism of Wenjing Tongluo Formula on oxaliplatin-induced perpheral neurotoxicity in rats. Methods Intraperitoneal injection was used to inject oxaliplatin 4 mg/kg to establish oxaliplatin-induced peripheral neurotoxicity rat models. Female Wistar rats were randomly divided into normal group， model group， and TCM group. TCM group was given Wenjing Tongluo Formula to soak rats limbs and tails. Rats in the model group were soaked with deionized water for comparison. Rats in the normal group received intraperitoneal injection with 5% glucose. Algesia hypersensitivity and anaphylaxis were detected under the mechanical stimulation and temperature. Immunohistochemical method was used to detect the expression of GFAP in L4-L6 spinal dorsal horn of rats. Explore the level of GLT-1 in L4-L6 dorsal root ganglia by RT-PCR. Results Rats in model group showed obvious behavioral changes compared with normal group （P<0.05）；Rats in the TCM group improved in behavioristics compared with model group （P<0.01）；number of positive cells in GFAP of rats in the model group increased compared with normal group （P<0.05）；the increase in the TCM group was not obvious. Compared with normal group， astrocytes in spinal dorsal horn of model group were enlarged， protuberances increased， became coarse， and GLT-1 mRNA is decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， active cells and protuberances in the TCM group decreased （P<0.01）， GLT-1 mRNA is increased （P<0.01）. Conclusion Wenjing Tongluo Formula can improve

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81173421）

通訊作者：賈立群，E-mail：liqun-jia@hotmail.com

behavioral changes of model rats under temperature and mechanical stimulation， probably related to harmful signal transmission induced by inhibition of astrocyte in spinal dorsal horn.

Key words：Wenjing Tongluo；oxaliplatin Formula；peripheral neurotoxicity；neuropathic pain；TCM external treatment；behavioristics；rats

腫瘤治療過程中，由化療藥物所引起的神經(jīng)病理性疼痛為臨床常見的不良反應(yīng)。奧沙利鉑是晚期大腸癌一、二線治療藥物，其對胃癌、卵巢癌、乳腺癌等均有效。隨著奧沙利鉑在臨床上的廣泛應(yīng)用，其導(dǎo)致的以感覺神經(jīng)障礙為特點的周圍神經(jīng)毒性成為目前國內(nèi)外腫瘤領(lǐng)域的研究重點之一[1]。本課題組前期臨床研究結(jié)果顯示，溫經(jīng)通絡(luò)散外用治療化療引起的周圍神經(jīng)毒性療效較好[2-3]。本研究通過復(fù)制奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性大鼠模型，探討溫經(jīng)通絡(luò)散的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量（210±10）g，8周齡，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥物

溫經(jīng)通絡(luò)散配方顆粒（老鸛草、川烏、紅花、桂枝等，中日友好醫(yī)院藥學(xué)部提供），用時取100 g顆粒溶于1000 mL去離子水中制成浸劑。奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號13081211），50 mg溶解于5%葡萄糖溶液，終濃度1 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。透皮劑月桂氮酮（Azone，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號2013z16）。

1.3 主要儀器與試劑

Von Frey纖維絲（North Coast Medical），丙酮（北京化工廠），BX51正置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）。通用型二抗（DAKO），Trizol（Invitrogen公司），多克隆兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（萬類生物），7500 RT-PCR儀（Applied Biosystems、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit BX51），Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組，每組15只。參照文獻[4]腹腔注射奧沙利鉑4 mg/kg，每周2次（分別于第1、2、8、9、15、16、22、23日注射），連續(xù)4周，建立周圍神經(jīng)毒性大鼠模型。造模第8日始，將溫經(jīng)通絡(luò)散浸劑加入1%月桂氮酮，浸泡大鼠四肢和尾部，每日2次，每次30 min，共23 d；模型組予常溫去離水加入1%月桂氮酮浸泡大鼠四肢和尾部[5]，正常組腹腔注射等體積5%葡萄糖。

2.2 行為學(xué)檢測

2.2.1 機械性痛覺過敏和超敏測試 將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明有機玻璃罩（23 cm×17 cm×13 cm），測試之前讓大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，待梳理探究活動基本消失后，分別采用4、15 g Von-Frey纖維絲刺激大鼠后肢足底，每側(cè)足底測量5次，2次刺激間隔6 s以上，大鼠在刺激時間內(nèi)或在移開纖維時立即出現(xiàn)快速的抬足反應(yīng)記為陽性反應(yīng)，而身體活動所引起的抬足反應(yīng)不記為陽性反應(yīng)。測試時記錄雙后肢抬足次數(shù)，并計算縮足百分率（陽性反應(yīng)次數(shù)÷10×100%[8]）。Von Frey纖維4 g刺激大鼠足底出現(xiàn)抬足反應(yīng)為機械刺激痛覺超敏反應(yīng)，Von Frey纖維15 g刺激大鼠足底出現(xiàn)抬足反應(yīng)為機械刺激痛覺過敏反應(yīng)。行為學(xué)檢測均于給藥后1 h進行[6-7]。

2.2.2 冷刺激過敏反應(yīng)測定 參照文獻[9]中丙酮噴灑的方法進行大鼠冷刺激過敏反應(yīng)的檢測，大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機玻璃罩，測試之前先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，待梳理探究活動基本消失后，將50 μL丙酮噴灑在大鼠后爪表面皮膚上，以丙酮開始噴灑時為0時，計時40 s，統(tǒng)計大鼠40 s內(nèi)縮足次數(shù)。左右各3次，共計6次。

2.3 大鼠脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達檢測

大鼠于末次給藥后24 h，0.9%戊巴比妥麻醉后取材。取L4～L6段脊髓，置于中性福爾馬林中固定48 h后進行脫水、石蠟包埋，沿縱軸最大縱切面連續(xù)5 μm厚切片18張。然后進行脊髓切片的GFAP免疫組化染色分析。BX51正置光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機取5個視野，Image Pro-Plus 5.0圖像分析軟件計數(shù)GFAP陽性細胞數(shù)。

2.4 RT-PCR檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體1 基因表達

實驗結(jié)束時，取大鼠雙側(cè)L4～L6背根神經(jīng)節(jié)，分離后迅速移至-80 ℃保存。Trizol法抽提RNA，取2 μg RNA用于合成cDNA。PCR引物序列：正向5-GCTGCT GGATAGAATGAGAACTTCGG-3（26 bp）、反向5-TTCCAA GGTTCTTCCTCAACACTGC-3（25 bp）。RT-PCR反應(yīng)：95 ℃、10 min進行預(yù)變性，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，擴增40個循環(huán)。結(jié)果采用ΔΔCt法進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，方差不齊采用Kruskal- Wallis H檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 不同時點溫經(jīng)通絡(luò)散對大鼠機械性痛覺超敏和過敏的影響

注射奧沙利鉑后，行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，模型組、中藥組大鼠較正常組出現(xiàn)明顯的機械性痛覺超敏和過敏反應(yīng)；給藥7 d后，中藥組大鼠痛覺超敏和過敏反應(yīng)較模型組明顯減輕，縮足百分率降低，且第23、30日行為學(xué)檢測中均低于模型組。結(jié)果見表1、表2。

4.2 不同時點溫經(jīng)通絡(luò)散對大鼠冷刺激過敏的影響

第3次注射奧沙利鉑后，模型組、中藥組與正常組比較，出現(xiàn)丙酮刺激后縮足反射次數(shù)明顯增多，以抬足、甩足、舔足為表現(xiàn)，并持續(xù)至第30日。中藥組大鼠冷刺激引起的感覺過敏反應(yīng)自給藥第7日開始下降，直至第30日。結(jié)果見表3。

4.3 溫經(jīng)通絡(luò)散對大鼠脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響

正常組大鼠雙側(cè)脊髓背角GFAP均正常少量表達，細胞胞體不明顯，染色較淺，星形膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)；與正常組比較，模型組可見脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細胞胞體增大，突起增多、變粗及GFAP陽性細胞明顯增多（P<0.01）；與模型組比較，中藥組活性細胞減少、突起減少（P<0.01）。結(jié)果見圖1、表4。

4.4 溫經(jīng)通絡(luò)散對大鼠背根神經(jīng)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體1基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（GLT-1）mRNA表達明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠GLT-1 mRNA表達明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表5。

5 討論

目前研究表明，星形膠質(zhì)細胞的激活及激活后產(chǎn)生的各種致痛物質(zhì)是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的必要條件[10-12]。GFAP是星形膠質(zhì)細胞特有的一種中間絲蛋白，被作為星形膠質(zhì)細胞活性狀態(tài)的標志之一而被廣泛使用[13]。國外研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性模型脊髓背角GFAP呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[14-16]，提示奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、維持與星形膠質(zhì)細胞活化、增多有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細胞較正常組胞體增大，突起增多、變粗，差異顯著，與文獻報道一致。表明星形膠質(zhì)細胞的確參與了奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性的調(diào)控。膠質(zhì)細胞包繞中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸、表達多種神經(jīng)遞質(zhì)及其受體，如P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、谷氨酸等[17]，在化療引起周圍神經(jīng)毒性大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，注射奧沙利鉑24 h后，P物質(zhì)在大鼠脊髓背角大量表達[18]；同時P物質(zhì)和CGRP與慢性神經(jīng)病理性疼痛的持續(xù)狀態(tài)高度相關(guān)[17-19]。這提示，增殖活化的星形膠質(zhì)細胞通過上述物質(zhì)參與著奧沙利鉑所致神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)機制。

谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與疼痛信息的傳遞。神經(jīng)損傷后，感覺傳入纖維谷氨酸和天冬氨酸釋放增加，過度激活中樞神經(jīng)谷氨酸受體，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元興奮性增強，并激活膠質(zhì)細胞。突觸間隙內(nèi)谷氨酸的重攝取主要依賴于興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運體（EAATs）的含量，而EAATs表達在神經(jīng)損傷或其他致病因素影響下發(fā)生改變。本實驗中EAATs家族中GLT-1在模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中顯著降低，即可能是奧沙利鉑導(dǎo)致了突觸間隙內(nèi)谷氨酸的增多，產(chǎn)生興奮性氨基酸毒性作用，致中樞敏化、脊髓星形膠質(zhì)細胞被激活。

本研究結(jié)果表明，奧沙利鉑可誘發(fā)大鼠神經(jīng)病理性疼痛，表現(xiàn)為機械性刺激的痛覺過敏、痛覺超敏和冷刺激引發(fā)的痛覺過敏，與文獻報道一致[6，20]。溫經(jīng)通絡(luò)散外用第7日開始，中藥組大鼠50%縮足閾較模型組明顯升高，直至第30日，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明溫經(jīng)通絡(luò)散外用可顯著改善奧沙利鉑所致的神經(jīng)病理性疼痛。其作用機制可能與抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細胞活化進而介導(dǎo)的傷害性信號傳遞有關(guān)。

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（收稿日期：2014-09-12；編輯：華強）