健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對脾虛慢性濕疹模型小鼠皮膚組織水通道蛋白3的影響

田靜 李忻紅 朱卉雯 馬賢德 馮常青 王敏

摘要：目的 觀察健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對脾虛慢性濕疹模型小鼠皮損處水通道蛋白3（AQP3）含量的影響，并探討其可能的作用機制。方法 取健康雄性小鼠50只，隨機分為正常組、模型組、陽性藥組及中藥高、低劑量組。采用小劑量反復(fù)DNCB涂抹及番瀉葉致脾虛證建立小鼠脾虛慢性濕疹模型。中藥組予健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方灌胃，陽性藥組予鹽酸左西替利嗪灌胃。免疫組化法檢測病變皮膚組織中AQP3的表達，同時觀察皮膚組織病理變化。結(jié)果 病理觀察結(jié)果顯示，健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對小鼠皮損處炎癥損傷具有一定的修復(fù)作用。與正常組比較，模型組AQP3過度表達；與模型組比較，各給藥組AQP3表達均明顯下降，染色強度降低。模型組AQP3平均光密度值明顯高于正常組（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組均能下調(diào)AQP3表達（P<0.05）。結(jié)論 健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方下調(diào)皮損中過度表達的AQP3可能是其治療脾虛慢性濕疹的作用機制之一。

關(guān)鍵詞：健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方；脾虛；慢性濕疹；水通道蛋白3；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.014

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0047-04

Effects of Jianpi Yangxue Qufeng Formula on Aquaporin-3 in Model Mice Skin Tissue with Chronic Eczema TIAN Jing1，2， LI Xin-hong2， ZHU Hui-wen1，2， MA Xian-de1， FENG Chang-qing2， WANG Min2 （1.Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China；2.Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Jianpi Yangxue Qufeng Formula （JPYXQF） on the AQP3 in mice with chronic eczema， and explore mechanism of action. Methods Fifty healthy male mice were randomly divided into 5 groups， namely normal group， model group， positive medicine group and JPYXQF high and low dose groups. Low-dose DNCB and Sennae Fominm were used to establish mice models of chronic eczema with spleen deficiency. JPYXQF groups were treated by JPYXQF for gavage， while the positive medicine group was treated by levocetirizine hydrochloride for gavage. The expression of AQP3 in mice skin tissue was detected by immunohistochemical method. At the same time， the pathological changes of skin were observed. Results The pathology of mice skin lesion showed that JPYXQF has certain recovery effects on the inflammation injury of skin lesion. Compared with the normal group， expression of AQP3 over expressed in model group. Compared with the model group， the expression of AQP3 in all treatment groups significantly decreased， and the staining intensity decreased. In the model group， the average optical density of AQP3 was significantly higher than that in the normal group （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment groups can reduce the expression of AQP3 in mice skin tissues （P<0.05）. Conclusion JPYXQF can reduce the over expression of AQP3 in skin lesion， which is probably its mechanism for the treatment of chronic eczema.

Key word：Jianpi Yangxue Qufeng Formula；spleen deficiency；chronic eczema；AQP3；mice

基金項目：遼寧省教育廳高等學(xué)校科學(xué)研究項目（L2012342）；遼寧省中醫(yī)藥學(xué)（專）科能力建設(shè)項目（2011-lnzyxzk-03）

慢性濕疹常由急性或亞急性濕疹反復(fù)發(fā)作轉(zhuǎn)化而來，也可起病即為慢性。臨床常表現(xiàn)為皮膚增厚、苔蘚樣變，黯紅或紫褐色，伴色素沉著或減退、抓痕、血痂，陣發(fā)性瘙癢。中醫(yī)認(rèn)為，脾主運化水濕，脾虛則濕濁內(nèi)生，脾虛與慢性濕疹的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。慢性濕疹病程較久，久病必傷及脾，脾虛濕郁，生化乏源，復(fù)感風(fēng)濕熱邪，致血虛、生風(fēng)生燥，繼而出現(xiàn)皮膚肥厚，瘙癢頑固難愈[1]。Elias等[2]提出皮膚屏障功能破壞可能是濕疹的致病因素。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一組與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，對維持人體內(nèi)水平衡有重要的意義，是維持體內(nèi)水液代謝平衡的分子學(xué)基礎(chǔ)。其中與皮膚相關(guān)的水通道蛋白主要是AQP3，其具有皮膚水合、屏障功能及創(chuàng)傷愈合的作用。

本研究選取AQP3作為研究指標(biāo)，采用脾虛慢性濕疹小鼠模型為研究對象，探討以健脾養(yǎng)血祛風(fēng)為原則的中藥組方對脾虛慢性濕疹的作用機制，為臨床治療方案的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種SPF級健康小鼠50只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（遼）2003-0016。分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水進食。實驗設(shè)計及實施過程中嚴(yán)格遵循動物實驗的3R原則[3]。

1.2 藥物

健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方（黨參15 g，白術(shù)15 g，山藥20 g，生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，制何首烏20 g，雞血藤20 g，防風(fēng)25 g，蒺藜10 g，白鮮皮20 g，甘草15 g）飲片購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，傳統(tǒng)方法煎煮濃縮，制成煎劑；番瀉葉，飲片購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。鹽酸左西替利嗪片，重慶華邦制藥有限公司，批號20130105，5 mg/片，用蒸餾水溶解制成混濁液。

1.3 主要試劑與儀器

2，4-二硝基氯苯（DNCB），解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站；丙酮，國藥集團化學(xué)試劑（沈陽）公司，DNCB用丙酮配制成7%和0.1%的濃度備用；SP法免疫組化檢測試劑盒，北京博奧森生物科技有限公司提供。電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）， WS2-261-79型電熱恒溫水浴箱（北京長安科學(xué)儀器廠），550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），石蠟包埋機（EG1150型，德國徠卡公司）。

1.4 造模

小劑量反復(fù)DNCB涂抹建立慢性濕疹模型[4-6]。將除正常組外40只小鼠腹部去毛（面積約2 cm×2 cm），實驗當(dāng)日，7%DNCB 25 μL涂于小鼠腹部剪毛區(qū)致敏，第2日強化1次，第5日背部剪毛（面積約2 cm×2 cm）， 第6日開始在鼠右耳雙面及背部剪毛區(qū)各涂抹0.1%DNCB 5、15 μL激發(fā)，每隔3 d 1次，共4次。觀察造模組小鼠的行為狀態(tài)，出現(xiàn)皮膚明顯增厚、粗糙、干燥，黯紅斑及褐色結(jié)痂，有少量毛發(fā)生長，小鼠回頭舔舐頻繁，煩躁不安明顯，即為造模成功。

參考文獻[7]建立番瀉葉致脾虛證小鼠模型。小鼠慢性濕疹模型造模第12日起加入脾虛造模程序。予小鼠灌服100%番瀉葉煎劑0.5 mL/只，每日1次，連續(xù)7 d。觀察造模組小鼠的行為狀態(tài)，是否出現(xiàn)精神倦怠、懶動、嗜臥、拱背、扎堆、眼瞇、毛色枯黃甚至稀少、耳尾色白、軟便、便溏、泄瀉、體質(zhì)量增加減慢或體質(zhì)量下降、體溫（肛溫）略有降低、食量減少等脾虛癥狀。出現(xiàn)5個以上癥狀即可認(rèn)為脾虛模型復(fù)制成功。

1.5 分組及給藥

采用隨機數(shù)字表法，將實驗小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組及中藥高、低劑量組，每組10只。末次激發(fā)24 h后給藥。小鼠給藥劑量根據(jù)人與小鼠體表面積比例進行換算，中藥高劑量組（含原藥材1.33 g）、中藥低劑量組（含原藥材0.33 g）、陽性藥組（含鹽酸左西替利嗪0.03 mg）0.4 mL/只灌胃。正常組及模型組予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)14 d。

1.6 取材

末次給藥后24 h，稱重，脫頸處死，取小鼠耳部正常及病變皮膚組織塊。

1.7 形態(tài)學(xué)觀察

取小鼠耳部皮膚組織，用10%甲醛溶液固定以做病理組織學(xué)檢查，HE染色，鏡下觀察各組耳部病變組織炎癥細胞浸潤情況。

1.8 水通道蛋白3表達檢測

免疫組化法對耳部皮膚組織AQP3表達水平進行檢測，應(yīng)用Leica Q550CW圖像采集和分析系統(tǒng)，測定單位面積陽性細胞的平均光密度值作為其表達情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠耳部皮膚組織病理觀察結(jié)果

正常組小鼠表皮無角化過度、增厚及海綿形成，真皮層無炎細胞浸潤，無血管擴張。模型組小鼠表皮角化過度，棘層肥厚，細胞間水腫不明顯，無表皮內(nèi)水皰，真皮血管周圍炎性浸潤明顯。中藥高劑量組小鼠表皮角化過度不明顯，棘層肥厚明顯減輕，真皮內(nèi)炎性浸潤顯著減少，內(nèi)皮細胞腫脹減輕。中藥低劑量組小鼠表皮角化過度及棘層肥厚，真皮內(nèi)炎性浸潤減少，內(nèi)皮細胞腫脹減輕。陽性藥組與中藥高劑量組結(jié)構(gòu)變化基本相似。各組小鼠耳部皮膚組織病理形態(tài)見圖1。

2.2 健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對小鼠耳部皮膚組織水通道蛋白3的影響

各組表皮細胞的細胞漿中均有不同程度的AQP3表達（淺褐色至棕褐色），正常組織中呈弱陽性表達，模型組平均光密度值明顯高于正常組（P<0.01）；與正常組比較，模型組AQP3表達明顯增強，棕褐色顆粒染色明顯加深；與模型組比較，各給藥組平均光密度值低于模型組（P<0.05），AQP3表達水平明顯下降，陽性產(chǎn)物減少。結(jié)果見圖2、表1。

正常組 模型組 陽性藥組 中藥高劑量組 中藥低劑量組

圖1 各組小鼠耳部皮膚組織病理形態(tài)（HE染色，×400）

正常組 模型組 陽性藥組 中藥高劑量組 中藥低劑量組

圖2 各組小鼠耳部皮膚組織AQP3表達（DAB染色，×400）

表1 各組小鼠皮膚組織中AQP3表達比較（—x±s，平均光密度值）

組別 只數(shù) AQP3

正常組 10 0.089±0.009

模型組 10 0.168±0.012△△

陽性藥組 10 0.126±0.005△△▲

中藥高劑量組 10 0.131±0.006△△▲

中藥低劑量組 10 0.151±0.008△△▲

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05

3 討論

慢性濕疹的發(fā)病機制尚未完全闡明，其病理上常表現(xiàn)為棘層肥厚，表皮突顯著延長，并有角化過度及角化不全，輕度的細胞間水腫。真皮上部血管周圍炎細胞浸潤，主要以淋巴細胞為多，毛細血管增多，內(nèi)皮細胞腫脹、增生。本實驗結(jié)果顯示，除正常組外，其余各組均在不同程度上出現(xiàn)表皮增厚、角化過度、真皮上部炎細胞浸潤、內(nèi)皮細胞腫脹。模型組小鼠耳部病理結(jié)果顯示，慢性濕疹模型復(fù)制成功，其病理變化基本符合慢性濕疹病理改變。而各給藥組小鼠耳部病理變化較模型組均有不同程度的改善。

雖然慢性濕疹的發(fā)病機制尚不清楚，但有學(xué)者提出皮膚屏障破壞，導(dǎo)致角質(zhì)層含水量下降可能是其重要原因[8]。AQP3在皮膚屏障功能中具有重要作用，其通過細胞內(nèi)外滲透壓的差異介導(dǎo)水進出細胞膜，從而參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外水的平衡，是維持體內(nèi)水液代謝平衡的分子學(xué)基礎(chǔ)。近年來，慢性濕疹發(fā)病機制與皮膚中AQP3表達受到關(guān)注。Nakahigashi等[9]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，AQP3過量表達可引起未成熟角質(zhì)形成細胞增殖、表皮增生、皮膚屏障功能受損，從而增加外源性抗原入侵皮膚的機會和導(dǎo)致皮膚高反應(yīng)性。宋氏等[10]研究顯示，AQP3在慢性濕疹患者表皮全層可見強陽性表達，并推測AQP3在慢性濕疹皮損中表達增強，可能為代償性補充角質(zhì)層水分及甘油，維持皮膚屏障功能。

本研究采用免疫組化法檢測小鼠皮膚組織中AQP3表達情況，實驗結(jié)果表明，模型組皮損中AQP3表達顯著增強，而病理上則表現(xiàn)為表皮角化過度，棘層肥厚，真皮血管周圍炎性浸潤明顯，內(nèi)皮細胞腫脹。筆者認(rèn)為上述表現(xiàn)與脾虛有著密切聯(lián)系。脾主運化，脾虛運化無權(quán)，水液不能正常輸布，而余濕羈留不去；脾虛散精失調(diào)，可致血虛，日久化燥生風(fēng)，肌膚失于濡潤，最終形成脾弱血虛風(fēng)燥的證候。經(jīng)健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方干預(yù)后，組織病理表現(xiàn)為棘層肥厚明顯減輕，真皮內(nèi)炎性浸潤顯著減少，內(nèi)皮細胞腫脹減輕。皮膚中AQP3表達明顯下降，這可能是健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方治療脾虛慢性濕疹的作用機理之一。方中黨參、白術(shù)健脾益氣除濕，共為君藥；生地黃、當(dāng)歸養(yǎng)血活血潤燥，共為臣藥；制何首烏、雞血藤養(yǎng)血活血通絡(luò)，防風(fēng)、蒺藜、白蘚皮祛風(fēng)除濕止癢共為佐藥；甘草補脾益氣，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏健脾除濕、養(yǎng)血潤燥、祛風(fēng)止癢之效。

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（收稿日期：2014-11-08）

（修回日期：2014-11-30；編輯：華強）