辣椒素對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI—H460細(xì)胞侵襲能力及E—鈣黏蛋白、Snail蛋白表達(dá)的影響

任公平等

摘要：目的 觀(guān)察辣椒素對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和Snail蛋白表達(dá)的影響，探討其抗非小細(xì)胞肺癌的可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)NCI-H460細(xì)胞，以不同終濃度辣椒素進(jìn)行處理，未加辣椒素為對(duì)照組。采用Hoechst33342核染色分析、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)，觀(guān)察辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡、侵襲能力及E-cadherin、Snail蛋白表達(dá)變化的影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，Hoechst33342核染色分析表明，辣椒素各濃度組可明顯誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡（P<0.05）；Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣椒素可顯著抑制侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)（P<0.05）；Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，辣椒素各濃度組E-cadherin表達(dá)水平明顯升高、Snail表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 辣椒素能明顯誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡；降低Snail表達(dá)、刺激E-cadherin的表達(dá)從而抑制NCI-H460細(xì)胞侵襲能力，可能是其抗非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：辣椒素；非小細(xì)胞肺癌；侵襲；E-鈣黏蛋白；Snail蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.015

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0055-04

Effects of Capsaicin on the Invasion Ability of Human Large Cell Carcinoma NCI-H460 and Expressions of E-cadherin and Snail REN Gong-ping1， LV Zheng-xin2， LIU Hong-yang3， LIANG Guo-ying4 （1.Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China；2.Jiamusi Hospital of TCM， Jiamusi 154002， China；3.Qiqihaer Hospital of TCM， Qiqihaer 161000， China；4.The First Affiliated Hospital to Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of capsaicin on the invasion ability of human large cell carcinoma NCI-H460 and the expressions of E-cadherin and Snail；To discuss the possible mechanisms of anti-non-small cell lung cancer. Methods NCI-H460 cells were cultured in vitro and treated with capsaicin at various concentrations， and no capsacin-treated group was set as control group. Effects of capsaicin on NCI-H460 apoptosis， its invasion ability， and the changes in protein expressions of E-cadherin and Snail were evaluated by Hoechst33342 nuclear staining assay， Transwell chamber invasion assay， and Western blot respectively. Results Compared with the control group， Hoechst33342 nuclear staining assay showed that capsaicin could induce NCI-H460 cell apoptosis （P<0.05）；Transwell invasion in vitro results showed that capsaicin could significantly inhibit invasion of penetrating cells （P<0.05）；Western blot analysis showed that E-cadherin expression level was significantly elevated and snail expression level significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Capsaicin can induce NCI-H460 cell apoptosis. Decrease the Snail expression and stimulate E-cadherin expression so as to inhibit the invasion ability of NCI-H460， which may be one of its mechanisms of anti-non-small cell lung cancer.

Key words：capsaicin；non-small cell lung cancer；invasion；E-cadherin；Snail

通訊作者：梁國(guó)英，E-mail：lianggy1976@163.com

據(jù)預(yù)測(cè)，到2020年，中國(guó)將有550萬(wàn)新發(fā)肺癌病例，死亡人數(shù)將達(dá)400萬(wàn)[1]。在肺癌病理學(xué)分型中，80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），包括腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致患者死亡及復(fù)發(fā)的主要原因，并使其成為當(dāng)今世界上對(duì)人類(lèi)健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[2]。近年來(lái)，關(guān)于辣椒素（capsaicin）抗癌作用的研究在國(guó)內(nèi)外日益受到學(xué)者的高度重視。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分。有研究表明，辣椒素可以抑制癌癥細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，因此，可作為一種藥物或傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥[3-5]。雖然辣椒素具有抗癌癥作用，但其有關(guān)NSCLC的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Snail蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，以期為NSCLC治療提供新思路，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及配制

辣椒素（純度>99%，美國(guó)Sigma公司），溶解于二甲基亞砜（DMSO），配成300 mmol/L溶液，-20 ℃保存。臨用時(shí)以完全培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司；Hoechst33342、牛血清白蛋白（BSA）、DMSO，美國(guó)Sigma公司；Transwell小室，美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠Matrigel，美國(guó)BD公司；E-cadherin、Snail、β-actin，上海浩然生物技術(shù)有限公司；E-cadherin鼠抗人單克隆抗體，美國(guó)ProMab公司；Snail兔抗人多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記抗鼠IgG二抗及HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗，上海碧云天公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-20AIC），日本SANYO；熒光顯微鏡（BX53），日本OLYMPUS；電泳儀（DYCZ-20B），北京六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDox XRS），美國(guó)Bio-RAD科技。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H460細(xì)胞保存在含有10%BSA的RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)NCI-H460細(xì)胞達(dá)80%匯合度時(shí)，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。按照細(xì)胞密度2×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于超低吸附6孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細(xì)胞，經(jīng)EDTA處理制備成單細(xì)胞懸液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，備用。

2.2 Hoechst33342核染色分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NI-H460細(xì)胞，按照細(xì)胞密度1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下過(guò)夜培養(yǎng)。次日，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素，對(duì)照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。每組設(shè)6個(gè)平行孔。37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，加入30 ?g/mL Hoechst33342 37 ℃，孵育30 min。熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況。隨機(jī)選擇不同視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，并分別計(jì)算凋亡細(xì)胞核數(shù)與正常細(xì)胞核數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算凋亡率[凋亡細(xì)胞核數(shù)÷（正常細(xì)胞核數(shù)+凋亡細(xì)胞核數(shù)）×100%]。

2.3 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[6]方法，Transwell小室用前鋪上50 ?L 0.5%Matrigel膜基質(zhì)37 ℃孵育過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對(duì)照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。按照細(xì)胞密度5×104個(gè)細(xì)胞/接種于Transwell小室內(nèi)室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的完全培養(yǎng)液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜細(xì)胞。甲醇固定15 min，以10 mg/mL Hoechst33342染色30 min。熒光顯微鏡計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western blot檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對(duì)照組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。用細(xì)胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，1.5%Triton X-100，150 mmol/L NaCl，10%甘油，1 mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF）和蛋白酶抑制劑（5 ?mol/L AEBSF-HCl，5 ?mol/L EDTA，10 mmol/L leupeptin，1.5 mmol/L E-64，pH 7.4）裂解細(xì)胞后，收集裂解液，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取20 ?g蛋白質(zhì)，加入等體積2×上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。隨后進(jìn)行7.5%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 ?m硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST（25 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）封閉1 h，分別加入E-cadherin、 Snail抗體（1∶1000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，PBST洗滌3次，每次5 min。按同法與β-actin抗體孵育。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)Bio-Rad凝膠成像進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/β-actin蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用—x±s表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33342染色結(jié)果顯示，辣椒素終濃度為300 ?mol/L時(shí)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞碎片或者核固縮呈致密濃染、凋亡小體等凋亡典型特征性改變，細(xì)胞凋亡率為39.4%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。辣椒素終濃度為100、200 ?mol/L時(shí)未見(jiàn)細(xì)胞凋亡和壞死，細(xì)胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

4.2 辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞體外侵襲能力的影響

Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，辣椒素終濃度為200、300 ?mol/L時(shí)，NCI-H460細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著下降（P<0.05），并呈濃度依賴(lài)性；辣椒素終濃度為100 ?mol/L時(shí)， NCI-H460細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)雖然減少，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

4.3 辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞E-鈣黏蛋白、Snail蛋白表達(dá)的影響

辣椒素終濃度為200、300 ?mol/L時(shí)，與對(duì)照組比較，E-cadherin表達(dá)水平顯著升高，Snail表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），并呈濃度依賴(lài)性；辣椒素終濃度為100 ?mol/L時(shí)，與對(duì)照組比較，E-cadherin和Snail表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

5 討論

辣椒素作為食物和傳統(tǒng)藥物已有幾千年的歷史，于1999年載入《美國(guó)藥典》[7]。辣椒素可通過(guò)多種途徑在體內(nèi)外發(fā)揮抗癌癥作用，有研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)[8]，辣椒素可誘導(dǎo)人黑色素瘤A375-S2細(xì)胞的凋亡[9]。然而，辣椒素對(duì)NSCLC是否具有抑制作用目前尚未明了。因此，本研究前期實(shí)驗(yàn)以不同終濃度辣椒素作用于NCI-H460細(xì)胞，觀(guān)察辣椒素抗NSCLC效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒素對(duì)NCI-H460細(xì)胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潛在的抗NSCLC效應(yīng)。

癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因。NSCLC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率更是居于原發(fā)性惡性腫瘤的前列[10]。因此，探討肺癌在分子水平的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尤為必要。增殖失控和惡性侵襲是癌癥細(xì)胞的兩大特征[11]。癌癥細(xì)胞的侵襲是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括癌癥細(xì)胞與基質(zhì)的黏附、基質(zhì)成分的蛋白水解、癌癥細(xì)胞通過(guò)基質(zhì)的缺損發(fā)生遷移3個(gè)步驟[12]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是促進(jìn)癌癥細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵因素，得到學(xué)者的廣泛認(rèn)可和關(guān)注。EMT改變細(xì)胞的行為，但大多數(shù)情況下，提高癌癥轉(zhuǎn)移的能力，包括增強(qiáng)原發(fā)癌癥細(xì)胞的遷移及抑制癌癥細(xì)胞凋亡。EMT最重要的標(biāo)志性變化是上皮細(xì)胞E-cadherin減少或丟失。E-cadherin是一種依賴(lài)Ca2+細(xì)胞間跨膜粘連糖蛋白分子，主要存在于上皮組織中，參與細(xì)胞間的連接，具有抑制癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的作用。E-cadherin表達(dá)下調(diào)或抑制和功能喪失都可以啟動(dòng)EMT，癌癥細(xì)胞經(jīng)過(guò)這種細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化獲得更高的侵襲性[13-14]。在對(duì)E-cadherin表達(dá)調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，Snail是EMT中的主要調(diào)節(jié)蛋白，是含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白。Snail能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抑制E-cadherin基因的表達(dá)，引起上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[15]。本研究中，以辣椒素處理NCI-H460細(xì)胞，Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣椒素可顯著抑制侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)，表明辣椒素可抑制癌癥細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，辣椒素可減少NCI-H460細(xì)胞Snail表達(dá)，刺激E-cadherin的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT，揭示辣椒素可能通過(guò)抑制Snail表達(dá)、增加E-cadherin的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲能力。同時(shí)Hoechst33342核染色分析還表明，辣椒素可誘導(dǎo)NCI-H460凋亡。

綜上所述，辣椒素具有明顯的NCI-H460細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)其凋亡。而且辣椒素可通過(guò)降低Snail表達(dá)，刺激E-cadherin表達(dá)抑制NCI-H460細(xì)胞侵襲能力，可能是其抗NSCLC機(jī)制。

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（收稿日期：2015-03-13）

（修回日期：2015-03-28；編輯：華強(qiáng)）