中樞疲勞恢復(fù)期大鼠海馬GDNF、GFRα—1mRNA及其蛋白表達的動態(tài)變化特征

陳萬等

摘要：目的：探討大鼠海馬組織膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF）、GDNF家族受體α-1信使RNA （GDNF？family receptor α-1mRNA，GFRα-1mRNA）及其蛋白表達在中樞疲勞后恢復(fù)期不同時相的動態(tài)變化特征。方法：雄性2月齡SD大鼠32只，隨機分為對照組（C組，n=8）、實驗組（E組，n=24）；E組進行7周疲勞模型運動后，又隨機分為運動后即刻組（E0組，n=8）、恢復(fù)期12 h組（E1組，n=8）、恢復(fù)期24 h組（E2組，n=8）。C組正?；\養(yǎng)，E組進行7周遞增負荷跑臺訓(xùn)練。經(jīng)7周疲勞模型運動后即刻，C組和E0組腹腔注射10%水合氯醛糖漿（03mL/100g）麻醉后取海馬組織，用于測定5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、多巴胺 （dopamine， DA）、GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達；E1組和E2組分別在恢復(fù)期12 h、24 h做上述同樣取材和測試。結(jié)果：1）大鼠經(jīng)7周遞增負荷跑臺訓(xùn)練后即刻，海馬組織5-HT升高（P<001），DA下降（P<001），DA/5-HT下降（P<005）。2）運動后即刻海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA相對表達率和GDNF、GFRα-1平均蛋白表達水平升高；恢復(fù)期12 h高于C組和E0組（P<001）；恢復(fù)期24 h降低并低于E1組（P<001）。結(jié)論：1）經(jīng)7周疲勞模型運動后大鼠已經(jīng)出現(xiàn)中樞疲勞。2）運動性中樞疲勞后大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達水平上升，提示GDNF和GFRα-1可能參與了中樞疲勞恢復(fù)的神經(jīng)生物學(xué)調(diào)控過程。

關(guān)鍵詞：中樞疲勞；運動性疲勞；大鼠；海馬組織；膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體

中圖分類號：G8047文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2015）02-0068-06

Abstract：Objective： To investigate the dynamic changing features of the glial cell line-derived neurotrophic factor （GDNF）， GDNF family receptor α-1mRNA （GFRα-1mRNA） and relative protein expression in hippocampus of rats during different phases of recovery period after fatigueMethods：32 male SD rats （2 month old） were randomly divided into control group （C group， n=8） and收稿日期：2015-03-10

基金項目：[山東省自然科學(xué)基金（ZR2009CQ032）。

作者簡介：[陳萬（1962-），男，江蘇南京人，博士，教授，研究方向運動與骨骼肌生物學(xué)效應(yīng)。

作者單位：[1山東體育學(xué)院，山東 濟南250102；2山東省微山縣實驗中學(xué)，山東 微山277600；3山東省體育科學(xué)研究中心，山東 濟南250102

1 Shandong Sport University， Jinan 250102， Shandong， China； 2 Weishan Experimental Middle School， Weishan 277600， Shandong； 3 Shandong Research Center of Sports Science， Jinan 250102， Shandong， China

experimental groups （E group， n=24） At the sampling time， the experimental groups were randomly divided into the group immediately （E0， n=8）， 12 h （E1， n=8）， and 24 h （E2， n=8） after exhaustive running All rats in experimental groups were assigned a 7-week training program increasing load by degrees with a final exhaustive running The 5-HT， DA， and the expressions of GDNF and GFRα-1mRNA from hippocampus of rats were measuredResults：All rats in experimental groups were assigned a 7-week training program increasing load by degrees Immediately after the last exhaustive running： 1） the hippocampus 5-HT was significantly higher（P<005）， and DA， DA/5-HT were significantly lower （P<001） than those of C group 2） The correspondence expression rates of GDNF and GFRα-1mRNA， and the protein expressions of GDNF and GFRα-1 were higher than those of C respectively 12h post-exercise， all indexes of E1 group were higher than those of C and E0， respectively （P<001） 24 h post-exercise， all indexes of E2 group were lower than those of E1（P<001）Conclusion： 1） The rat was instantly reach central fatigue after treadmill movement after 7 weeks 2） While exercise-induced central fatigue occurs， there are up-regulations in the levels of expression of GDNF， GFRα-1mRNA and protein in rat hippocampus， which indicates that both GDNF and GFRα-1mRNA have participated in neurobiological regulation process recovered from exercise fatigue

[WTHZ]Key words：[WTBZ]central fatigue；exercise-induced fatigue； rat； hippocampus； glial cell line-derived neurotrophic factor （GDNF）； GDNF family receptor alpha-1

運動性疲勞可能同時發(fā)生在外周和中樞部位，中樞疲勞能破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本穩(wěn)態(tài)，使大腦調(diào)控隨意肌運動的機能下降，主要表現(xiàn)在運動皮層以及運動神經(jīng)元的興奮降低、神經(jīng)沖動發(fā)放不足，從而導(dǎo)致運動單位激活數(shù)量不夠[1]。研究表明[2-5]，膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （Glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF） 對多巴胺能神經(jīng)元有較強營養(yǎng)和修復(fù)作用，能挽救損傷的多巴胺能神經(jīng)元并促進其恢復(fù)，有效保護中腦的多巴胺循環(huán)，而多巴胺又是影響中樞疲勞的重要因素。GFRα-1是GDNF最主要的受體，GDNF與其受體GFRα結(jié)合形成GDNF-GFRα復(fù)合體，激活Ret受體，促使細胞內(nèi)Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體形成，Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體激活相關(guān)蛋白引起一系列信號傳導(dǎo)，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[6-8]。

本研究通過對運動性中樞疲勞恢復(fù)期大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1 mRNA及其蛋白表達水平變化的觀察，分析GDNF、GFRα-1表達在恢復(fù)期不同時相的動態(tài)變化特征，探究中樞疲勞產(chǎn)生的神經(jīng)生物學(xué)機制，為消除運動性中樞疲勞提供理論依據(jù)。

1研究對象與方法

1.1研究對象及分組

32只健康雄性SD大鼠 （2月齡），（220±10）g，山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。常規(guī)分籠喂養(yǎng)普通鼠全價顆粒飼料Ⅱ號飼料（北京實驗動物研究中心提供），自由飲水進食，動物室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%。

32只健康雄性SD大鼠隨機分為：對照組 （C組，n=8，不進行訓(xùn)練）；實驗組 （E組，n=24），疲勞模型運動后隨機分為運動后即刻組 （E0組，n=8）、恢復(fù)期12 h組 （E1組，n=8）、恢復(fù)期24 h（E2組，n=8）。

1.2研究方法

1.21疲勞模型運動方案

本實驗中疲勞模型運動方案依據(jù)Bedford等[9]研究者的回歸方程理論進行設(shè)計。國內(nèi)研究者汶希等[10]報道，采用每周7次，連續(xù)2周的運動方案 （15×15、15×15、18×20、18×20、18×25、18×25、20×25；25×25、25×25、25×30、25×30、30×30、30×30、30×30 m/min×min，坡度0°），大鼠下丘腦γ-氨基丁酸 （gamma-aminobutyric acid， GABA）和5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine， 5-HT） 含量顯著升高，多巴胺 （dopamine， DA） 和乙酰膽堿 （acetylcholine， Ach） 含量顯著性下降，表明出現(xiàn)中樞和外周疲勞。為了有效地導(dǎo)出中樞疲勞，本實驗參考國內(nèi)外學(xué)者[9-12]的運動疲勞模型，增加了運動強度（跑臺速度）和周數(shù) （速度和時間安排見表1）。

1.22動物取材及樣本處理

7周疲勞運動后即刻，C組和E0組大鼠腹腔注射10%水合氯醛糖漿（03 mL/100g） 麻醉，斷頭后立即在冰面上分離腦區(qū)海馬組織，備測 5-HT、DA、和GDNF、GFRα-1 mRNA及蛋白表達等。E1組和E2組大鼠分別在7周疲勞運動后12 h和24 h取材 （方法同上）。將海馬組織稱重后放入1 mL組織勻漿器中，加入01 mol/L高氯酸1 mL和005%Na2EDTA混合水溶液1 mL，在冷環(huán)境下勻漿，將勻漿液用超速冷凍離心機，4℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于EP管內(nèi)以測5-HT、DA。

1.23指標測試

1.24RNA抽提及cDNA的合成

RNA抽提及cDNA的合成過程具體操作方法嚴格按照RIAZLRNA試劑盒（美國Invitrogen公司，專利號：5346994）、EasyScript cDNA第一鏈合成試劑盒（北京Tiangen Biotech公司）說明書進行。總反應(yīng)體系20 uL，置于55℃～60℃中溫育 10 min 使其加快溶解，提取的RNA立即用于cDNA的合成。

1.25引物設(shè)計

所有引物設(shè)計由上海迪奧生物科技有限公司設(shè)計及合成，GFRα-1上游引物5-CTATCGTCCCTGTGTGCTCCT-3，下游引物5-CACACTGAGGCTGCTGGAGT-3；GDNF上游引物5-GAACCAAGCCAGTGTATCTCCT-3，下游引物5-ATCGTCTCTGCCTTTGTCCTC-3；β-Actin上游引物5-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3，下游引物5-CAGAGGCATACAGGGACAGC-3[13]。

1.26Real-time PCR檢測

反應(yīng)體系在ABI 7000 Fast Real-time PCR System上進行，PCR反應(yīng)體系（20ul反應(yīng)體系）包括：SYBR Premix Ex Taq TM緩沖液10 μl，ROX染料04 μl，上下游引物（10uM）各04 ul，cDNA模板20 ul，滅菌蒸餾水68 ul，共20 ul。擴增第一步，95℃ 30 s預(yù)變性；第二步，95℃ 5 s、60℃ 30 s，PCR反應(yīng)40個循環(huán)；第三步，95℃ 15 s、60℃ 60 s，95℃ 15 s解離。實時檢測每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強度，通過對熒光強度的分析完成等量檢測的目的[13]。

1.27海馬組織免疫組織化學(xué)染色

海馬組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定4 h后進行石蠟切片制備，切片脫蠟和水化后經(jīng)PBS溶液沖洗，嚴格按照免疫組織化學(xué)染色步驟、DAB顯色試劑盒和GDNF、GFRα-1抗體試劑盒要求進行。

1.3統(tǒng)計方法

采用SPSS170軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標準差 （[AKx-]±s）表示。C組、E0組、E1組、E2組四組之間采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，并進行后續(xù)檢驗的多重比較（Post Hoc Multiple Comparisons）。顯著性水平為P<005，非常顯著性水平為P<001。

2結(jié)果

2.1海馬組織5-HT、DA、DA/5-HT測試結(jié)果[WTBZ]

對大鼠海馬組織勻漿上清液進行5-HT、DA指標測試，結(jié)果如表3所示，經(jīng)疲勞模型運動后，E0組、E1組、E2組5-HT都升高（P<001），E1組、E2組高于E0組（P<001），E2組低于E1組（P<005）。E0組、E1組DA都降低（P<001）；E1組低于E0組（P<005），但E2組高于E0組（P<005）；運動后24 h E2組升高（P<005）。E0組、E1組、E2組DA/5-HT降低（P<005）；E1組低于E0組（P<001）；E2組高于E1組（P<001）。[WTBZ]

2.2海馬組織GDNF、GFRα-1 mRNA相對表達率測試結(jié)果

大鼠海馬組織GDNFmRNA、GFRα-1mRNA相對

2.3大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1平均光密度值測試結(jié)果

免疫反應(yīng)陽性細胞，表現(xiàn)為較為粗大的棕黃或棕褐色顆粒分布于細胞漿，見圖2、3。大鼠海馬組織的GDNF平均光密度值，E1組高于E0組和C組（P<001），E2組較E1組降低（P<001）。大鼠海馬組織的GFRα-1平均光密度值，E1組高于E0組和對照C組（P<001），E2組較E1組降低（P<001），結(jié)果如表4所示。

3討論與分析

3.1大鼠海馬組織5-HT、DA、DA/5-HT比值變化

5-HT是一種抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，腦組織內(nèi)的5-HT參與多種神經(jīng)生理功能的調(diào)節(jié)過程，如情緒變化、體溫調(diào)節(jié)、睡眠等，同時又與力量感知、肌肉疲勞存在較為密切的關(guān)系。有研究者報道[14-16]，大強度或力竭運動后大鼠腦組織不同區(qū)域的5-HT含量升高，使得神經(jīng)遞質(zhì)的相對平衡遭到破壞，引起中樞紊亂，從而產(chǎn)生中樞疲勞。

從本實驗結(jié)果分析（見表3），疲勞模型運動后即刻，大鼠海馬組織5-HT含量顯著升高 （P<001），與上述研究報道結(jié)果相似，說明中樞神經(jīng)抑制明顯加強，出現(xiàn)中樞疲勞；運動后12 h，5-HT含量進一步升高到峰值（P<001），說明本實驗采用的運動疲勞模型的運動強度 （跑臺速度） 相對較大、時間較長，造成的中樞神經(jīng)抑制進一步加深，疲勞程度也在運動后12 h達到最大；運動后24 h，5-HT在單胺氧化酶的作用下氧化分解，生成酸性代謝產(chǎn)物—5-羥吲哚乙酸等產(chǎn)物[14]，促使5-HT呈下降趨勢。

DA是首次被證明在中樞疲勞中發(fā)揮作用的一種神經(jīng)遞質(zhì)，能激發(fā)并促進肌肉協(xié)調(diào)能力等。以往的研究結(jié)果[16-19]顯示，力竭運動或長時間大強度運動后，大鼠端腦、中腦、下丘腦等部位的DA含量顯著性下降，同時DA/5-HT比值明顯降低，認為DA/5-HT比值變化更能準確反映中樞疲勞狀況，DA/5-HT比值的明顯降低可能是導(dǎo)致中樞疲勞的主要因素之一。

本實驗結(jié)果分析，第2～7周的長時間中大強度的運動導(dǎo)致大鼠海馬組織DA的合成水平明顯降低，但隨著休息時間增長和多巴胺受體功能性增強，多巴胺遞質(zhì)分泌量逐漸增多，所以24 h后DA呈上升趨勢，結(jié)合前人研究的結(jié)論[16-18， 20]，說明本實驗中大鼠經(jīng)過運動疲勞模型運動后已達到中樞疲勞狀態(tài)。

3.2大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1 mRNA及蛋白表達

GDNF與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員。研究證實，機體在進行長時間大強度訓(xùn)練時，為避免神經(jīng)元過度損傷，而發(fā)生自我保護性應(yīng)答使海馬組織神經(jīng)元BDNF表達水平相對升高[21-22]。GDNF受體是由細胞膜外的GDNFRα和Ret蛋白組成，Ret蛋白則是各個GDNFRα受體的共同的配基；GDNF受體的存在是神經(jīng)元對GDNF產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的前提。

[JP2]研究表明[3-4， 7， 23]，GDNF生物學(xué)效應(yīng)的機制是由于GDNFRα固定于細胞膜的外層，沒有跨膜部分，傳導(dǎo)信號受阻，因此GDNF首先與具有高度親和力的GDNFRα結(jié)合發(fā)揮協(xié)同作用，促進GDNFRα與Ret蛋白的結(jié)合，進而激活Ret蛋白的磷酸化，而Ret蛋白磷酸化后可激活下一步細胞內(nèi)的信息傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮GDNF的生物學(xué)效應(yīng)。GDNF可以直接作用于DA神經(jīng)元，對其有明顯的營養(yǎng)和促存活作用[8， 23]。國內(nèi)學(xué)者也通過實驗證明GDNF能夠較強的促進出生后早期大鼠中腦DA能神經(jīng)元的存活、分化、再生的表達[6]。無論是離體實驗還是在體實驗都表明GDNF具有營養(yǎng)支持多巴胺神經(jīng)元的作用，表現(xiàn)為能夠顯著提高中腦DA水平，促進多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯增加[23]。[JP]

本研究大鼠經(jīng)過7周疲勞模型運動后，測得運動后即刻、運動后12 h、24 h時大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達，結(jié)果顯示（圖1和表4），在以上三個時間點變化呈現(xiàn)先上升，運動后12 h時達到最高，然后下降趨勢。該研究中大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達出現(xiàn)先升后降，經(jīng)深入分析討論得出可能由以下原因造成：第一、大鼠經(jīng)本實驗疲勞模型運動后已經(jīng)達到中樞疲勞狀態(tài)，海馬組織的DA明顯下降，并且運動后恢復(fù)期12 h內(nèi)繼續(xù)下降。眾多研究已經(jīng)證實無論是在體還是離體，GDNF都具有能夠為DA存活提供營養(yǎng)、支持和促進的功能，提升DA的表達水平[6-8， 23-24]。所以當該實驗大鼠中樞疲勞后海馬組織DA活性降低時，加速了海馬組織GDNFmRNA和GFRα-1mRNA相互結(jié)合作用，提高了GDNF蛋白表達能力。隨著恢復(fù)時間的延長，大鼠海馬組織的DA活性逐漸升高，GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達相應(yīng)逐漸降低，到運動后24h時明顯降低，且與運動后即刻無明顯差異。第二、大鼠在進行該疲勞模型這種長時間大強度訓(xùn)練時，機體為了防止過度疲勞或損傷，而發(fā)生的一系列自我保護應(yīng)答反應(yīng)。即長時間大強度運動導(dǎo)致中樞疲勞后，海馬組織神經(jīng)元細胞的疲勞甚至損傷，誘導(dǎo)了神經(jīng)營養(yǎng)因子的高效表達，這種較高的表達能夠減輕損傷程度，并有效促進了細胞損傷的修復(fù)與再生[6]。運動后伴隨恢復(fù)時間的延長和運動過程中機體所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)得到有效補充，GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達逐漸恢復(fù)到正常水平。第三、GDNF對運動神經(jīng)元（Motor neuron， MN）的作用。實驗證實GDNF對MN具有廣泛的、有效的營養(yǎng)作用，能挽救、修復(fù)損傷后的MN，還能夠維持離體MN的存活并促進其生長。這些功能是在已發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子中僅有的，而GDNF以上功能的發(fā)揮可能與其能夠有效阻止乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性下降有關(guān)[3-4，25]。本實驗大鼠中樞疲勞過程中，大鼠MN受到不同程度的損傷或是死亡，而損傷的MN修復(fù)則需要GDNF提供部分的營養(yǎng)，所以此時GDNF的表達就會提高。

在本實驗中，7周疲勞模型運動后恢復(fù)期24 h內(nèi)，大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達水平變化特征顯示，大鼠海馬神經(jīng)細胞可通過GDNF及GFRα-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來降低神經(jīng)細胞的損傷程度，有效促進損傷神經(jīng)細胞的修復(fù)和再生，以加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因而提示，GDNF、GFRα-1參與了促進中樞疲勞恢復(fù)的神經(jīng)生物學(xué)調(diào)控過程。

4結(jié)論

4.1大鼠海馬組織5-HT、DA等指標的變化表明，7周疲勞模型運動后大鼠出現(xiàn)中樞和外周疲勞，而且24 h后疲勞仍未完全恢復(fù)。

4.2中樞疲勞后恢復(fù)期大鼠海馬組織GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表達水平的動態(tài)變化特征顯示，GDNF及其受體GFRa-1參與了促進中樞疲勞恢復(fù)的神經(jīng)生物學(xué)調(diào)控過程。

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