褪黑素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的影響及作用機(jī)制的研究*

潘海媛，嚴(yán)星，姜鵬

(1.解放軍第82醫(yī)院呼吸科，江蘇淮安223001;2.解放軍第82醫(yī)院骨科)

褪黑素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的影響及作用機(jī)制的研究*

潘海媛1，嚴(yán)星1，姜鵬2＊＊

(1.解放軍第82醫(yī)院呼吸科，江蘇淮安223001;2.解放軍第82醫(yī)院骨科)

目的探討褪黑素(MLT)對(duì)體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，通過(guò)不同濃度的褪黑素(0、0.1、0.5、1.0mmol/L)干預(yù)24、48、72h，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力變化，Transwell侵襲小室測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MLT對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響，RT－PCR法檢測(cè)MLT對(duì)細(xì)胞中NF－κBp65 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果褪黑素能夠抑制人肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲能力，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)NF－κBp65mRNA量明顯減少。結(jié)論褪黑素能夠呈劑量依賴(lài)性抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的遷移及侵襲，抑制核因子κBp65基因的轉(zhuǎn)錄是可能作用路徑之一。

褪黑素;肺腺癌;核因子κB;遷移;侵襲

肺癌是最常見(jiàn)的腫瘤之一，并且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，這與全世界的工業(yè)化、空氣污染、吸煙等有關(guān)，其治療手段多樣，包括手術(shù)、放療、化療及生物治療，尤其是分子靶向治療發(fā)展迅速，但總體治療效果并不令人滿(mǎn)意，5年存活率較低，腫瘤的早期轉(zhuǎn)移可能是治療效果不佳的重要原因。褪黑素是一種主要由松果體分泌的天然激素［1］，最早的研究重點(diǎn)是其生物鐘作用［2］，近年來(lái)的研究表明，褪黑素可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］、拮抗某些生長(zhǎng)因子如血管生成、侵襲等促進(jìn)因子、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力［4］、對(duì)其他治療的協(xié)同作用［5］、調(diào)節(jié)心理狀態(tài)［6］等發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究主要探討褪黑素對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑人肺腺癌A549細(xì)胞由唐都醫(yī)院胸外科實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑:胎牛血清(四季青公司)，低糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，褪黑素(Sigma公司)，人工基底膜材料(Matrigel)及Transwell小室(BD公司)，Trizol試劑盒及RTPCR試劑盒(Takara公司)。主要儀器:電熱恒溫干燥箱(北京科偉永興儀器公司)，顯微鏡(徠卡公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio－Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組復(fù)蘇凍存的人肺腺癌A549細(xì)胞，加入含雙抗(青霉素、鏈霉素各100 U/ ml)體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2恒溫37℃、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2d換液，以后隔天更換培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞約80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。根據(jù)我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1.0mmol/L的MLT 48h內(nèi)對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，實(shí)驗(yàn)按照MLT濃度分為4組(n=4)，MLT終濃度分別為0mmol/L(對(duì)照組control)、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MLT對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響0.25%胰酶消化細(xì)胞，10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化并吹打成細(xì)胞懸液，按3×104/孔接種入24孔板內(nèi)，每組設(shè)6孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至細(xì)胞融合約60%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吸出培養(yǎng)液，用200μl槍頭小心在孔底劃痕，用無(wú)血清培養(yǎng)液將洗滌2次，吸凈，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下選擇劃痕較直且無(wú)細(xì)胞殘留的部位板底劃線標(biāo)記并拍照記錄，繼續(xù)培養(yǎng)。24h后吸去培養(yǎng)液，換加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，并加入不同量MLT，使其終濃度分別為0mmol/L、0.1 mmol/ L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)18h，取出24孔板，對(duì)照第1次照片，顯微鏡下尋找拍照部位，相同放大倍數(shù)再次拍照。按照細(xì)胞遷移距離= (24h前細(xì)胞間距－24h后細(xì)胞間距)/2計(jì)算細(xì)胞實(shí)際遷移距離。以對(duì)照組平均距離記為1，各實(shí)驗(yàn)組取相對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。

1.2.3 Transwell侵襲小室測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MLT對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響實(shí)驗(yàn)前晚從20℃冰箱中取出人工基底膜材料，4℃過(guò)夜融化成液態(tài)，用4℃培養(yǎng)基10倍稀釋。吸取50μl稀釋后的基底膜材料滴入8μm Transwell小室中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h。4h后吸出小室內(nèi)未凝固液體，將小室懸掛入24孔板內(nèi)待用。胰酶消化細(xì)胞，不含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹打成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至約2.5×105/ml，每小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液180μl，并加入MLT濃度為0 mmol/L、1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L的不含血清培養(yǎng)基20μl，小室外加含10%FBS的培養(yǎng)基500μl，每濃度設(shè)6個(gè)小室。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h后取出小室，棉簽擦去基底膜上層細(xì)胞，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30min，蘇木素染色，自來(lái)水沖洗。400倍顯微鏡隨意選取16個(gè)視野計(jì)數(shù)，以對(duì)照組細(xì)胞平均數(shù)記為1，各實(shí)驗(yàn)組取相對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。

1.2.4 RT－PCR法檢測(cè)MLT對(duì)細(xì)胞中NF－κBp65mRNA表達(dá)的影響將肺腺癌A549細(xì)胞懸液按3×104/孔接種入24孔板中，每濃度設(shè)6孔，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后吸去培養(yǎng)液，換加含10%FBS的培養(yǎng)基，并加入含不同濃度MLT的培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0mmol/L、0.1 mmol/ L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用Trizol試劑盒提取總RNA。根據(jù)NF－κBp65基因序列設(shè)計(jì)引物序列，上游引物為5＇－CCACTTACGGATTCTGGTGG－3＇，下游為5＇－CTCAAACGCTGGTGTTAGGC－3＇，長(zhǎng)度426bp;β－actin內(nèi)參基因上游引物為5＇－GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA－3＇，下游引物為5＇－GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG－3＇，長(zhǎng)度496bp(引物由上海生工合成)。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，重復(fù)30個(gè)循環(huán);擴(kuò)增β－actin基因:94℃預(yù)變性5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后凝膠成像分析系統(tǒng)分析，以對(duì)照組平均值記為1，各實(shí)驗(yàn)組取相對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示，對(duì)主要數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組間比較采用SNK－q檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照公式算得細(xì)胞遷移距離，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，0 mmol/L、0.1mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L各組遷移距離為1、0.790±0.148、0.582 ±0.119、0.327±0.062。經(jīng)檢驗(yàn)，各濃度加藥干預(yù)組與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，0.5 mmol/L組與0.1mmol/L組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，1mmol/L組與其他各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示褪黑素能抑制A549細(xì)胞的遷移能力，且作用呈一定劑量依賴(lài)性。

2.2Transwell侵襲小室測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組小室基底膜下層細(xì)胞染色后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，各濃度分別為1、0.856±0.081、0.476±0.064、0.301± 0.069。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，0.1 mmol/L組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，0.5 mmol/L組、1.0 mmol/L組與對(duì)照組及比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05)，組間比較顯示1.0mmol/L與0.1mmol/L組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，1.0mmol/L與0. 5mmol/L組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果提示，MLT能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲能力，并且表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

2.3 RT－PCR結(jié)果RT－PCR結(jié)果顯示，隨著MLT濃度的增高，細(xì)胞NF－κBp65 mRNA逐漸下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示MLT呈劑量依賴(lài)性的抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)圖1。

圖1 MLT對(duì)A549細(xì)胞作用后NF－κBp65的Rt－PCR檢測(cè)

3 討論

姜鵬［7］等人實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高濃度的MLT對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.1～1.0 mmol/L的MLT作用24h對(duì)A549細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)選擇0.1～1.0mmol/L之間的濃度作為實(shí)驗(yàn)條件，以避免細(xì)胞增殖受明顯抑制對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

通過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)MLT能夠抑制腫瘤的遷移和侵襲能力，并且呈一定的劑量依賴(lài)性，提示MLT可能有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防。

NF－κB是一種細(xì)胞中普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，非活化時(shí)以p50/p65異二聚體形式在胞漿中存在［8］，并與特異性的調(diào)節(jié)蛋白IκB－α結(jié)合，在IκB激酶(IKK)作用下p50/p65異二聚體可與IκB－α分離，并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與特定啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA的合成［9～11］，參與炎癥、細(xì)胞增殖及凋亡多種生理病理反應(yīng)［12］。多項(xiàng)研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF－κB呈非正?；罨癄顟B(tài)［13］，參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。有研究證實(shí)，NF－κB異?；罨瘯r(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子、血管細(xì)胞粘附分子、金屬蛋白酶等的表達(dá)［14，15］，參與浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。p65亞基是NF－κB的主要活性亞基［16］，活化后發(fā)生核移位與目的DNA結(jié)合后調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)［17］。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MLT能夠下調(diào)NF－κBp65mRNA量，這說(shuō)明MLT對(duì)NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MLT能通過(guò)抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但MLT如何抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)解釋。

［1］Pandi－Perumal SR，Srinivasan V，Maestroni GJM，et al. Melatonin:nature＇s most versatile biological signal?［J］. FEBS J，2006，273(13):2813

［2］Hunt AE，Al－Ghoul WM，Gillette MU，et al.Activation of MT2 melatonin receptors in rat supra chiasmatic nucleus phase advances the circadian clock［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2001，280(1):C110

［3］Mediavilla MD，Cos S，Sanchez－Barcelo EJ.Melatonin increases p53 and p21WAF1 expression in MCF－7 human breast cancer cells in vitro［J］.Life Sci，1999，65(4):415

［4］García－Navarro A，González－Puga C，Escames G，et al. Cellular mechanisms involved in the melatonin inhibition of HT－29 human colon cancer cell proliferation in culture［J］.J Pineal Res，2007，43(2):195

［5］Rato AG，Pedrero JG，Martinez M，et al.Melatonin blocks the activation of estrogen receptor for DNA binding［J］. FASEB J，1999，13(8):857

［6］Giuseppina Messina，Paolo Lissoni，Paolo Marchiori，et al. Enhancement of the efficacy of cancer chemotherapy by the pineal hormone melatonin and its relation with the psychospiritual status of cancer patients［J］.J Res Med Sci，2010，15(4):225

［7］姜鵬，楊俠，楊波，等.褪黑素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖及核轉(zhuǎn)錄因子κBp65核移位的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(13):2457

［8］Hayden MS，Ghosh S.Signaling to NF－κB［J］.Genes Dev，2004，18(18):2195

［9］Devin A，Cook A，Lin Y，et al.The distinct roles of TRAF2 and RIP in IKK activation by TNF－R1:TRAF2 recruits IKK to TNF－R1 while RIP mediates IKK activation［J］. Immunity，2000，12(4):419

［10］Yang J，Lin Y，Guo Z，et al.The essential role of MEKK3 in TNF－induced NF－κB activation［J］.Nat Immunol，2001，2(7):620

［11］Chen ZJ.Ubiquitin signalling in the NF－κB pathway［J］. Nat Cell Biol，2005，7(8):758

［12］Aggarwal BB.Nuclear factor－κB:the enemy within［J］. Cancer Cell，2004，6(3):203

［13］Sarkar FH，Li Y.NF－κB:a potential target for cancer chemoprevention and therapy［J］.Front Biosci，2008，13: 2950

［14］Yang J，Mani SA，Donaher JL，et al.Twist，a master regulator of morphogenesis，plays an essential role in tumor metastasis［J］.Cell，2004，117(7):927

［15］Huber MA，Beug H，Wirth T.Epithelial－mesenchymal transition:NF－κB takes center stage［J］.Cell Cycle，2004，3(12):1477

［16］Li T，Hu J，He GH，et al.Up－regulation of NDRG2 through nuclear factor－kappa B is required for Leydig cell apoptosis in both human and murine infertile testes［J］. Biochim Biophysica Acta，2012，1822(2):301

［17］Donato AJ，Black AD，Jablonski KL，et al.Aging is associated with greater nuclear NF－Κb，reduced IκBα，and increased exression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans［J］.Aging Cell，2008，7(6):805

The Effect and Mechanism of Melatonin on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells

PAN Hai－yuan，YAN Xing，JIANG Peng
(Department of Respirations NO．82 Hospital of PLA，Huaian Jiangsu 223001，China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of melatonin(MLT)on the migration and invasion of cultured human lung adenocarcinoma A549 cell.MethodsHuman lung adenocarcinoma A549 cells were treated by different concentration of melatonin(0，0.1，0.1，1.0 mmol/L)for 24，48 or 72 h.The migration changes were tested by the scratch test.The effect of MLT on the invasive ability of A549 cells were measured by transwell invasion.RT－PCR was used to detect the effects of MLT on NF－κBp65 mRNA expression.ResultsMelatonin can inhibit the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell accompanying with reducing the amount of NF－κBp65mRNA cells.ConclusionMelatonin can dose－dependently inhibit the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell.Inhibition of NF－κBp65 mRNA gene transcription is one of the possible role of the path.

Melatonin;Lung adenocarcinoma;Nuclear factor κB;Migration;Invasion

R734.2

A

2095－4646(2015)01－0009－04

2014－10－15)

淮安市科技支撐項(xiàng)目(HAS2012020)

＊＊通訊作者，E－mail:bigbird01@163.com